【图文】绿色荧光蛋白(GFP)技术在细胞生物学研究中的应用

1、 10 GFP报告蛋白用于细胞活体分离与纯化 n 利用细胞表面标记，通过流体细胞分光光度计或荧光活化细胞筛选仪(FACS， 可以分离与纯化特殊类型细胞，对分析cDNA文库、研究基因的细胞发育或 组织专一性表达十分重要26,27。利用GFP融合蛋白为细胞表面活体荧光 标记，通过筛选已经获得GFP表达的大肠杆菌、人体肾细胞和猿猴COS-1细 胞特殊类型。Sheen J等在GFP转染玉米原生质体的流体参数分析中发现， 转染1518小时后，对照中只有一类细胞丛，表现较强红色荧光和微弱的绿 色荧光，并且细胞间荧光强度相当一致，没有明显差异。而GFP转染的原生 质体中出现两类细胞丛，第一类与对照相似，呈现

2、红色荧光，约占细胞总数 66.3%；第二类细胞丛呈现绿色荧光，荧光强度是对照的74倍。因此，用流 式细胞分光光度计或荧光活化细胞筛选仪(Epics Elite, Conlter Electronics,Miami FL, USA很容易将两类细胞分离开来。原生质体可以来 源于不同类型的组织细胞原生质体表达的GFP信息，即可代表某种组织的信 息。采用发育专一性启动子构建GFP表达载体，可以将这些具有基因表达特 异性的细胞类型分离出来。利用不同表达文库转染原生质体，通过流体参数 分析和细胞分类，可以揭示在信号传导途径中所包含的许多反方活化因子 (trans-activating fectors。GF

3、P在生物学和分子生物学研究中的利用还不 仅仅局限于上述几个方面。随着研究的深入开展，其广泛利用的潜力将不断 表现出来。 四、存在的问题及展望 n n GFP标记蛋白有很明显的优点，但这项技术还是有很多的局限性。第一，这种方法需 要很高的空间分辨力，培养的细胞要稀疏而且很薄；第二，定量的范围会受到融合蛋 白表达水平和显像分辨力的干扰；第三，因为融合蛋白扩散到膜表面需要一定的时间， 因此动力学响应在某些情况下可能会受到时间上的限制；第四，由GFP标记物本身引 起的电势干扰是很难估计的，因为几乎没有其它的方法可以用来做比较；第五，几乎 在所有的情况下,细胞内GFP标记分子的表达都伴随着一些未标记蛋白

4、的表达。例如,组 成高尔基反面网状结构的膜蛋白TGN38，它的正确功能定位和动力学过程需要在同源 系统中低水平的表达，而在非同源系统中表达或在同源系统中高水平表达，则会导致 其断裂或被错误地定位28。第六，GFP的分子量虽然不大(27kDa，但对蛋白功能 的影响比一些短的(大约10个氨基酸荧光标记蛋白要大。最后，虽然有报道指出，荧 光只能在表达GFP的细胞中检测到，但是也有不少人担心GFP基因可能还不能完全准确 地反映转化情况，GFP基因的表达可能有假象存在：一方面，细胞本身存在一些可以 受光激发的物质，能产生一定量荧光；另一方面，GFP基固在受体内的表达频率并不 高。Sheen等(1995在

5、一些被CAB GFP基因转化的植株中检测不到清晰的荧光信号。 Hu、Sheen、Haselof等l995年在发表的文章中也分别提到了这一现象，看来GFP的 应用条件还需进行进一步的摸索。 GFP成像技术是生化和分子细胞生物学中飞速发展的一个工具,它已经渗透到了分子生 物学、遗传学、动物学、植物学、生理学等其它许多生命科学领域。有了GFP，培育 出奇特的荧光动物和荧光植物已不再是梦想。相信随着基因工程技术和细胞工程技术 的日益成熟，GFP一定可以为我们揭开细胞中许多迄今为止还不为人所知的秘密,掀起 一场生物学上的绿色革命。 n n n n n n n n n n n n n n n 14Yuk

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