植物组织中丙二醛含量蛋白质含量及过氧化物酶活力的测定

1、生物化学实验五植物组织中丙二醛含量、蛋白质含量及过氧化物酶活力的测定学生：吴潇潇 学号：0812134 指导老师：张芬琴（河西学院生命科学与工程系 08（1）班 甘肃张掖 734000）摘要：以三叶草和草坪草的叶片为材料，分别采用丙二醛法、考马斯蓝法及酶活力测定的方法对三叶草及草坪草叶片内丙二醛含量、蛋白质含量及过氧化物酶活力进行对比测定。实验结果表明：草坪草内丙二醛含量高于三叶草的，且都在532nm处吸光值最大；三叶草叶片内蛋白质含量高于草坪草叶片的；三叶草叶片中过氧化物酶活力大于草坪草叶片的。关键词：三叶草 草坪草 丙二醛含量 蛋白质含量 过氧化物酶活力 对比引言：丙二醛 (MDA)，无色

2、针状晶体，熔点 7274，一般含两个结晶水，60下真空干燥可得无水物，易潮解，纯的丙二醛在中性条件下稳定，但在酸性条件下不稳定。由乙醛和甲酸乙酯在碱作用下缩合而得，可在高真空下升华精制，主要用于医药中间体、感光色素的原料。与蛋白质不相容，有潜在的致癌性。生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性。蛋白质（protein）由C、H、O、N组成，一般蛋白质可能还会含有P、S、Fe、Zn、Cu、B、Mn、I等。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，都是由20种标准氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新并时刻

3、处于动态平衡中。酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适.1.材料与方法1.1 材料采集及使用试剂1.11材料采集：实验材料三叶草与草坪草

4、分别取其叶片于自来水中冲洗，然后用吸水纸将水吸干待用。1.12试剂：0.5%硫代巴比妥酸溶液 20%三氯乙酸（TCA） 1mg/ml牛血清蛋白溶液 考马斯亮蓝溶液 0.01mol/ml磷酸缓冲液 0.02mol/ml愈创木酚 一定浓度过氧化氢溶液1.2 方法1.21三叶草丙二醛提取：分别取0.5克三叶草与草坪草叶片于研钵中，加石英砂和1ml蒸馏水，研成匀浆，转移到试管中，再用1.5ml蒸馏水分两次洗研钵，合并提取液加入2.5ml0.5%硫代巴比妥酸溶液, 摇匀沸水加热10min(自有气泡开始计时)，冷却至室温离心15min取上清液量其体积V以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白对照分别测其在450n

5、m、532nm、600nm下的吸光度。1.22蛋白质含量的测定：如（1）制的提取液后，分别加入5ml缓冲液，再于12000r/min 分离提取上清液，并量上清液体积，用于蛋白质含量测定和酶活力测定。如下表配置好溶液后摇匀，5minhou 后以1号管为空白对照,在595nm处测定POD值。 表1.221溶液标准曲线的测定及溶液OD值 试管号 1 2 3 4 5 67 8100ug/ml标准蛋白（ml）0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 样品（ ml）0.2 0.20.15mol/L NaCl （ml） 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.8考马斯亮蓝试剂 （ml） 5

6、.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0A595nm       0. 0.137 0.288 0.360 0.524 0.604 图1.221标准蛋白质含量及吸光值曲线图1.222三叶草与草坪草蛋白质含量1.23过氧化物酶活力的测定：如表1.231所示读取470nm处吸光值。 表1.231溶液配置及其吸光值 试剂 对照管 样品（三叶草） 样品（草坪草）0.01mol/ml磷酸缓冲液/ml 2.4 2.3 2.30.02mol/ml愈创木酚/ml 0.5 0.5 0.5 提取酶液/ml 0 0.1 0.1 过氧化氢

7、/ml 0.1 0.1 0.1 混合后读出OD值，3min后再读出OD值，作差OD值差 0 0.927 0.236 1.24SDS-PAGE电泳实验步骤：1.241安装夹心式垂直板电泳槽：目前，夹心式垂直板电泳槽有很多型号，虽然设置略有不同，但主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。同学们可根据具体不同型号要求进行操作。1.242配胶：本实验采用SDS-PAGE不连续系统，按下表的配制分离胶和浓缩胶。表1不同浓度分离胶、浓缩胶的配制试剂名称配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂/ml配制10ml浓缩胶所需试剂5%7.5%10%15%3%分离胶贮液 （30%Acr-0.8%Bis)3.335.006

8、.6610.00-分离胶缓冲液 （pH8.9Tris-HCl）2.502.502.502.50-浓缩胶贮液 （10%Acr-0.5%Bis）-3.0浓缩胶缓冲液 （pH6.7 Tris-HCl）-1.2510% SDS 0.200.20 0.20 0.20 0.101%TEMED 2.002.002.002.002.00重蒸馏水 11.8710.208.545.204.60混匀后，置真空干燥器中，抽气10min10%AP0.100.10 0.10 0.10 0.051.243制备凝胶板：（1）分离胶制备：按表配制20ml 10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8

9、cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约34mm高，以进行水封。约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。（2）浓缩胶的制备：按表配制10ml 3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约30min后凝胶聚合，再放置2030min。待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。 1.2

10、44样品处理及加样 各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.51mg/mL，沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用。处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1分钟，以消除亚稳态聚合。 一般加样体积为1015L（即210g蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。 1.245电泳  将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA。待样品进入分离较时，将电流调至2030 mA。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一

11、块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。 1.246染色及脱色 将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，脱色后立即拍照。用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。1.25 SDS-PAGE电泳 图1蛋白质电泳图谱图2 POD同工酶电泳图谱2.结果与分析1.21结果分析：532 nm处测得吸光值最大；草坪草叶片内的丙二醛含量高于三叶草的。因为草坪草机体内纤维素含量远大于三叶草的而且丙二醛在酸性和高温条件下，可以与硫代巴比妥酸反应生成红棕色的三甲川，其最大吸收波长在532 nm。1.22结果分析：由图1.222可见，三叶草中

12、蛋白含量大于草坪草的，原因可能是叶是光合作用、呼吸作用的主要器官。宽大肥厚的三叶草叶片比窄而薄的草坪草叶片易合成并储存蛋白质。图1.231三叶草与草坪草酶活力1.23由图1.231可见，三叶草中过氧化物酶活力大于草坪草的，原因可能是三叶草的蛋白质含量高于草坪草的。1.25结果分析：蛋白质电泳图谱对比可看出，三叶草蛋白质迁移率比草坪草蛋白质迁移率高，说明三叶草中蛋白质含量比草坪草中蛋白质含量高。POD同工酶电泳图谱对比可看出，三叶草POD同工酶电泳条带比草坪草的多，由此表明三叶草容易受低温环境的影响。3.讨论 三叶草属于蝶形花科，草坪草属于草本科，它们是两个不同科的植物。叶草叶片中丙二醛含量高于草坪草含量，由此可以说明三叶草叶片的膜脂过氧化程度比草坪草的高，其抗低温的能力较弱。三叶草中蛋白含量大于草坪草的，由此可以说明宽大肥厚的三叶草叶片比窄而薄的草坪草叶片易合成并储存蛋白质。过氧化氢(H2O2)是氧化酶催化的氧化还原反