原始不加密温州医学院临床免疫学检验

1、第十五章第十五章 流式细胞仪分析技术及应用流式细胞仪分析技术及应用温州医科大学检验医学院温州医科大学检验医学院 林向阳林向阳内容提要内容提要n流式细胞仪的原理流式细胞仪的原理n数据的显示与分析数据的显示与分析n流式细胞仪免疫分析的技术要点流式细胞仪免疫分析的技术要点n流式细胞术在免疫学检查中的应用流式细胞术在免疫学检查中的应用流式细胞分析仪流式细胞分析仪基本概念基本概念p流式细胞仪流式细胞仪(Flow Cytometer)是集激光技术，计算机技术，细胞荧光化学染色技术，单抗技术等为一体的高科技细胞分析仪。p流式细胞术流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)一种能快速、精确对单个细胞（

2、生物颗粒）的理化和生物学特性进行多参数定量分析和分选的新技术。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量第一节第一节 流式细胞仪的原理流式细胞仪的原理工作原理工作原理液流系统：液流系统：单细胞流技术单细胞流技术 流动室流动室鞘液鞘液样本流样本流SAMPLE SAMPLE 单细胞悬液单细胞悬液5 5* *10105 5 1 1* *10106 6个个/ml /ml 光学系统：光学系统：单细胞照明技术单细胞照明技术 光源光源: :激光激光( (常用氩离子气体激光器常用氩离子气体激光器488nm ) ) 光束成形系统光束成形系统 数据处理系统：数据处

3、理系统：单细胞检测技术单细胞检测技术 光电倍增管（光电倍增管（PMT)PMT) A/DA/D转换转换计算机计算机细胞分选细胞分选 一、基本结构一、基本结构液流系统示意图液流系统示意图喷嘴喷嘴FluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambeam鞘液鞘液光学系统示意图光学系统示意图FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS FS DetectorDetector 细胞在液柱中与激光束相交时向周围方向细胞在液柱中与激光束相交时向周围

4、方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关。胞内颗粒折射等有关。主要分为主要分为前向散射光前向散射光和侧向散射光侧向散射光。二、散射光的测定二、散射光的测定前向散射光（前向散射光（Forward ScatterForward Scatter）FSFS的强度与的强度与细胞的大小细胞的大小有关有关 FSFS常被用于设阈以排除样品中各种碎片对被测细胞的干扰。常被用于设阈以排除样品中各种碎片对被测细胞的干扰。侧向散射光（侧向散射光（Side ScatterSide Scatter）SSSS的强度与细胞内部结构的形态学信息，特别是细胞浆

5、的强度与细胞内部结构的形态学信息，特别是细胞浆中的中的颗粒性成分颗粒性成分有关有关 。 测得的测得的FSFS与与SSSS信信号通过计算机处理，号通过计算机处理，可得到可得到FS-SSFS-SS图，由此图，由此可仅用散射光信号对可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行未染色的活细胞进行分析或分选。分析或分选。 淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞中性粒细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群从非均一群体中鉴别出某些亚群 n荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激光荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发激发后后产生，发射的荧光波长与激发光波长产

6、生，发射的荧光波长与激发光波长不同不同。n每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色。n选择不同的单抗及荧光染料就可同时测定一个细胞上的多个选择不同的单抗及荧光染料就可同时测定一个细胞上的多个不同抗原的特征。不同抗原的特征。三、荧光的测量三、荧光的测量4 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5荧光补偿荧光补偿荧光染料荧光染料 激发波长激发波长 (nm) 发射波长发射波长(nm) 用途用途 颜色颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫

7、荧光 橙红 PeCy5 488 675 免疫荧光 红 PI 488 620 DNA染色 橙红 PeCy7 488 755 免疫荧光 深红 常用荧光染料的特性常用荧光染料的特性细胞悬液形成液流柱细胞悬液形成液流柱流动室振动流动室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含细胞的液滴含细胞的液滴弃去弃去偏转落入收集器偏转落入收集器压电晶体压电晶体产生产生机械振动机械振动不充电不充电充电充电四、分选基本原理四、分选基本原理n分选速度分选速度n分选纯度分选纯度n分选得率分选得率分选的技术要求分选的技术要求n参数：参数：FS,SS,FLFS,SS,FLn数据显示方式数据显示方式 （单参数直方图（单

8、参数直方图 、双、双参数散点图参数散点图 、二维等高图、二维等高图 、假三维、假三维等高图等高图 、三参数散点图、三参数散点图 ）n设门分析技术设门分析技术 第二节第二节 数据的显示与分析数据的显示与分析FSFS：反映细胞的大小：反映细胞的大小SSSS：反映细胞的内部结构复杂程度：反映细胞的内部结构复杂程度FLFL：反映细胞被染上的荧光数量多少：反映细胞被染上的荧光数量多少一、参数一、参数细胞相细胞相对数量对数量信道信道(channel(channel ) )单参数直方图单参数直方图二、数据的显示方式二、数据的显示方式单参数直方图单参数直方图双参数散点图双参数散点图双参数散点图双参数散点图 等

9、高线显示图等高线显示图 三参数直方图三参数直方图假三维等假三维等高图高图 当细胞标记了多色荧光，被激发光激发当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。需要进行组合分析。多参数分析多参数分析 GateGate设置：指在某一张选定参数的直方图设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的分析的特定细胞群特定细胞群，并要求该样本所有其，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。布情况。在线设门和离线设

10、门在线设门和离线设门根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。形门、多边形门、任意形状门和十字门。 三、三、设门分析技术设门分析技术A A 淋巴细胞淋巴细胞B B 单核细胞单核细胞C C 中性粒细胞中性粒细胞A A、B B、C C均均为任意门为任意门线性门线性门D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字门分析时，就如十字门分析时，就可以由四个区域构成，可以由四个区域构成，即即G=D1+D2+D3+D4。 Region设置设置u免疫检测样本制备免疫检测样本制备u标

11、记染色标记染色u免疫胶乳颗粒技术的应用免疫胶乳颗粒技术的应用u质量控制质量控制 第三节第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要点流式细胞仪免疫分析的技术要点外周血淋巴细胞样品的制备：外周血淋巴细胞样品的制备：分离单个核细胞或溶血分离单个核细胞或溶血培养细胞的样品制备：培养细胞的样品制备： 蛋白酶消化蛋白酶消化 机械吹打机械吹打 使贴壁细胞脱落使贴壁细胞脱落 洗涤洗涤 尼龙网过滤尼龙网过滤新鲜实体组织单细胞悬液的制备新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法、酶处理法、化学试剂处理法、表面活性剂处理法机械法、酶处理法、化学试剂处理法、表面活性剂处理法一、免疫检测样品制备一、免疫检测样品制备单细胞悬液的保存：

12、单细胞悬液的保存： 深低温保存法深低温保存法 乙醇或甲醇保存法乙醇或甲醇保存法 甲醛或多聚甲醛固定法甲醛或多聚甲醛固定法荧光染色：荧光染色：荧光染料标记的抗体与细胞抗原成分特异结合的过程。荧光染料标记的抗体与细胞抗原成分特异结合的过程。方法：方法：间接免疫荧光染色间接免疫荧光染色 ： 间接免疫荧光标记方法有信号放大作用，但其非特异干扰信号也较强。间接免疫荧光标记方法有信号放大作用，但其非特异干扰信号也较强。直接免疫荧光染色直接免疫荧光染色 ： 常用细胞表面标志的染色分析。常用细胞表面标志的染色分析。二、荧光染色二、荧光染色n液相芯片液相芯片n利用免疫胶乳颗粒的载体特性，结合荧光标记和利用免疫胶

13、乳颗粒的载体特性，结合荧光标记和FCMFCM检测技术实现对检测技术实现对多种可溶性物质的分析。多种可溶性物质的分析。 三、免疫胶乳颗粒技术的应用三、免疫胶乳颗粒技术的应用流式微球陈列流式微球陈列n单细胞悬液内不能有团块及过多的细胞碎片单细胞悬液内不能有团块及过多的细胞碎片n细胞悬液最适密度为细胞悬液最适密度为0.50.510106 6-1.5-1.510106 6个个/ml/mln可选择不同的分离方法。可选择不同的分离方法。 n温度温度25-3725-37，pH7.0-7.2pH7.0-7.2n尽快检测。尽快检测。四、流式细胞免疫学技术的质量控制四、流式细胞免疫学技术的质量控制（一）单细胞悬液

14、制备的质控（一）单细胞悬液制备的质控n温度：温度：荧光淬灭，荧光淬灭，2020npHpH：FITCFITC对对PHPH敏感敏感n染料浓度染料浓度n固定剂：固定剂：1-4%1-4%的多聚甲醛的多聚甲醛（二）免疫荧光染色的质控（二）免疫荧光染色的质控n光路与流路校正光路与流路校正: : 确保激光光路与样品流处于正交状确保激光光路与样品流处于正交状态。态。Flow-checkFlow-check CV:2%-3% CV:2%-3%nPMTPMT（光电倍增管）校准（光电倍增管）校准: : 保证样品检测时仪器处于保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。最佳灵敏度工作状态。n绝对计数校准绝对计数校准:

15、: 保证计数的准确性。保证计数的准确性。绝对计数校准品绝对计数校准品（三）仪器操作的质控（三）仪器操作的质控n同型对照：即免疫荧光染色中的阴性对照，选用同型对照：即免疫荧光染色中的阴性对照，选用同源性同源性标标记相同荧光素的非特异性免疫球蛋白。记相同荧光素的非特异性免疫球蛋白。非特异性荧光染色非特异性荧光染色n全程质量控制：样本染色、溶血、洗涤、仪器质控、和上全程质量控制：样本染色、溶血、洗涤、仪器质控、和上机检测机检测全过程全过程。（四）免疫检测的质控（四）免疫检测的质控全血质控品全血质控品 流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各

16、方面，用流式基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。加了有效的手段和帮助。 第四节第四节 免疫学检验中的应用免疫学检验中的应用T T淋巴细胞及其亚群分析淋巴细胞及其亚群分析Th(CD3+CD4+ T); Tc(CD3+CD8+ T)B淋巴细胞及其亚群分析淋巴细胞及其亚群分析B1(CD19+CD5+):产生产生IgM型自身抗体型自身抗体, 参与免疫调节、与自参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关身免疫病的发生有关B2(

17、CD19+CD5-):受外来抗原刺激受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体产生高亲和性特异性抗体NK细胞分析细胞分析NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴细胞及其亚群的分析一、淋巴细胞及其亚群的分析n细胞介导细胞毒性试验：细胞介导细胞毒性试验： CTLCTL和靶细胞共同体外培养，对靶细胞的杀伤作用和靶细胞共同体外培养，对靶细胞的杀伤作用 死细胞与活细胞比例，死细胞与活细胞比例，PIPI能渗透到死细胞致核染色能渗透到死细胞致核染色n细胞内细胞因子测定：细胞内细胞因子测定： 对对CD3+CD4+TCD3+CD4+T细胞内细胞内IFN-IFN-和和IL-4IL-4来区分来区分Th1Th1和和

18、Th2Th2二、淋巴细胞功能分析二、淋巴细胞功能分析1 1分离细胞分离细胞2 2刺激培养刺激培养3 3细胞破膜与固定细胞破膜与固定4 4染色与分析染色与分析 基本步骤基本步骤三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型n对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型n用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变MDR(+)表示对化疗药物耐药表示对化疗药物耐药P P糖蛋白（糖蛋白（P-gpP-gp）：跨膜分子，泵出进入胞内：跨膜分子，泵出进入胞内的多种抗癌药物。的多种抗癌药物。 四、肿瘤耐药相关蛋白分析四、肿瘤耐药相关蛋白分析五、五、AIDS病检测中的应用病检测中的应用CD4+Th细胞、细胞、CD4+/CD8+比例比例绝对计数值相对计数值表达强度流式细胞仪检测结果显示流式细胞仪检测结果显示CD4+ T细胞总 T细胞艾滋病人艾滋病人CD4细胞细胞HLA-B27可出现在可出现在58%97%的强直的强直性脊椎炎性脊椎炎(As) 患者患者六、自身免疫病相关六、自身免疫病相关HLA抗原分析抗原分析 流式细胞术的交叉配型（流式细胞术的交叉配型（FCXM） 群体反应性抗体（群体反应性抗体（PRA）检测）检测七、移植免疫中的应用七、移植免疫中的