Calphostin C对乳腺癌细胞增殖的抑制作用及相关机制

1、Calphostin C对乳腺癌细胞增殖的抑制作用及相关机制         11-01-07 10:56:00     编辑：studa20           作者：千新来，崔静，任峰，赵杰，冶亚平，贺国洋，李新强，朱慧芳，韩芳毅，杨慧林，王霞，原志庆 【摘要】  目的 研究Calphostin C对乳腺癌细胞MDAMB435S增殖的影响及初步机制。方法

2、 通过观察Calphostin C处理MDAMB435S细胞前后细胞的生长速度、倍增时间、克隆形成率和细胞周期分布等变化，探讨Calphostin C对MDAMB435S细胞增殖的影响；通过Western blotting、免疫细胞化学染色和RTPCR等方法探讨Calphostin C影响MDAMB435S细胞增殖的初步机制。结果 与MDAMB435S亲本细胞(对照组)相比，Calphostin C处理的MDAMB435S细胞(实验组)生长速度明显减慢，倍增时间明显延长(P<0.01)，并且呈现浓度和时间依赖性；对照组和实验组细胞克隆形成率分别为(82.33±6.81)%和(2

3、2.00±1.73)%，差异有统计学意义(P<0.01)；实验组细胞周期出现明显的G1期阻滞(P<0.01)。Western blotting和免疫细胞化学染色结果显示，与对照组细胞相比，实验组细胞中蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)表达没有明显变化，但活性状态(胞质转位至胞膜)的PKC显著减少。Western blotting和RTPCR结果显示，与对照组细胞相比，实验组细胞中p53、Cyclin A和Cyclin B表达没有明显变化，但p21表达上调，Cyclin E表达下调。结论 Calphostin C可显著抑制乳腺癌细胞MDAMB435S的

4、增殖，该作用可能与其抑制PKC活性、上调p21表达和下调Cyclin E表达有关。 【关键词】  钙磷酸蛋白C；蛋白激酶C；乳腺癌；增殖 China)ABSTRACT: Objective  To explore the effects of Calphostin C on the proliferation of breast carcinoma cells (MDAMB435S) and its preliminary mechanism. Methods  The effects of Calphostin C on the proliferation of

5、 MDAMB435S cells were studied by observing changes of the growth rate, doubling time, cloneforming efficiency, and distribution of cell cycle of MDAMB435S cells before and after Calphostin C treatment. Furthermore, the mechanism involved was analyzed by Western blotting, immunocytochemistry and RTPC

6、R assay. Results  Compared with those of the parental MDAMB435S cells (control group), the growth rate was suppressed markedly and the doubling time was prolonged significantly (P<0.01) in the MDAMB435S cells treated with Calphostin C (experimental group), and the changes presented concentra

7、tion and timedependence patterns. Furthermore, the cloneforming efficiency in control group and experimental group was (82.33±6.81)% and (22.00±1.73)%, respectively, with a significant difference (P<0.01). Moreover, for the experimental group cells, the cell cycle arrested in G1 phase (

8、P<0.01). The results from Western blotting and immunocytochemical staining indicated that compared with that of the parental MDAMB435S cells, the expression of protein kinase C (PKC) did not change significantly, but PKC in active status (transposition from cytoplasm to cytomembrane) was decrease

9、d dramatically in the MDAMB435S cells treated with Calphostin C. Western blotting and RTPCR results showed that compared with that of the parental MDAMB435S cells, the expression of p53, Cyclin A and Cyclin B had no significant changes, while the expression of p21 was increased and the expression of

10、 Cyclin E was decreased in the MDAMB435S cells treated with Calphostin C. Conclusion  Calphostin C could suppress markedly the proliferation of MDAMB435S cells, which may be correlated to the abilities of inhibiting PKC activity, upregulating the expression of p21 and downregulating the express

11、ion of Cyclin E.KEY WORDS: Calphostin C; protein kinase C; breast carcinoma; proliferation肿瘤细胞过度增生与有丝分裂信号途径相关基因过度表达密切相关，而蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的过度激活在后者中起重要作用1，提示PKC的过度激活可能与肿瘤的发生发展有关。越来越多的证据显示,多种肿瘤(如乳腺癌、恶性神经胶质瘤等)组织中PKC的表达和活性都远高于相应的正常组织2。因此，PKC是一个潜在的有价值的抗肿瘤治疗靶点1。PKC特异抑制剂钙磷酸蛋白(Calphostin)是一类菌类分支孢

12、子菌属分子孢子提取物，以Calphostin C最具代表性34。乳腺癌的发生率在世界范围内仍呈上升趋势，我国乳腺癌发生率增加速度(3%5%)明显高于世界平均水平(1.5%)5。鉴于以上研究及国内、外尚未见Calphostin C对乳腺癌作用的相关报道，本研究拟以乳腺癌细胞MDAMB435S为研究对象，探讨Calphostin C对乳腺癌细胞增殖的影响和初步机制。1  材料与方法1.1  材料Calphostin C为美国Calbiochem公司产品；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)为杭州四季青公司产品；逆转录聚合酶链反应(reverse trans

13、criptionpolymerase chain reaction, RTPCR)试剂盒、Taq DNA聚合酶和dNTPs等为美国Promega公司产品；Trizol试剂、蛋白分子量标准、100bp DNA Markers和DMEM/F12培养基等为美国Invitrogen公司产品；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和吉姆萨染料等为美国Sigma公司产品；DBA试剂盒和增强化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)试剂盒购自中杉生物技术有限公司；PKC鼠抗人单克隆抗体和通用型PV6000两步法免疫细胞化学试剂

14、盒为美国Zymed公司产品；Cyclin E兔抗人多克隆抗体、p21和actin鼠抗人单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品。PCR引物由上海生物工程有限公司合成(表1)。表1  引物序列和目的片段（略）乳腺癌细胞系MDAMB435S购于中国科学院上海细胞库，培养条件为含100mL/L FBS和青/链霉素(青霉素100u/mL、链霉素100mg/L)的DMEM/F12培养基，于37、50mL/L CO2孵箱中培养。用DMSO溶解Calphostin C，配制为100mol/L，-20避光保存备用。1.2  方法取对数生长期MDAMB435S细胞接种24孔板(2

15、5;104/孔)，常规培养24h后，更换为含不同浓度Calphostin C(0.05、0.10、0.25、0.50nmol/L和1.00nmol/L)的培养基，设不加药组和DMSO对照组。各组均设3个复孔，每天每个浓度计数3孔细胞，共计数6d，求均值，绘制细胞生长曲线，并按公式TD=t×log2/(logNt-logN0)计算倍增时间(TD)，t代表培养时间，N0代表起始计数获得的细胞数，Nt代表培养t时间后计数获得的细胞数。取对数生长期MDAMB435S细胞接种6个培养瓶(1×102/瓶)，常规培养24h后，随机选择其中3瓶更换为含0.1nmol/L Calphosti

16、n C的培养基，3h后再更换为不含Calphostin C的培养基(实验组)，另外3瓶作为对照组。培养21d后，用甲醇固定，吉姆萨染色，计数克隆数(50个细胞/克隆)，求均值，并计算克隆形成率(克隆形成率=平均克隆数/接种细胞数×100%)。取6瓶对数生长期MDAMB435S细胞，随机选择其中3瓶更换为含0.1nmol/L Calphostin C的培养基(实验组)，另外3瓶作为对照组。3h后收集细胞，固定、染色后应用流式细胞仪测定DNA含量，计算机分析细胞周期并绘制细胞周期分布直方图。接种对数生长期MDAMB435S细胞于6张载玻片上，常规培养24h后，随机选择其中3张更换为含0.1nmol/L Calphostin C的培养基(实验组)，另外3张作为对照组。3h后取出载玻片进行免疫细胞化学染色。按Zymed公司的PV6000两步法免疫细胞化学试剂盒说明书进行。PKC单克隆抗体稀释倍数为150，PBS代替抗作为阴性对照。用Trizol试剂提取对数生长期的MDAMB435S亲本细胞(对照组)和Calphostin C(0.1nmol/L)处理3h的MDAMB4