流式细胞仪上机培训手册

1、流式细胞仪上机操作培训手册一、样本处理以PBMC表面抗原的流式检测步骤为例1) 取样。取新鲜提取或冻存后复苏的PBMC；2) 编号。根据实验设计，标记好流式管，如每份PBMC设两管：a) 1号管：相应同型对照；b) 2号管：CD3,CD4,CD8,CD56四标管；3) 加样。用移液器取100ul细胞/管（约1×106个细胞/管），分别加到已经标记好的流式管底部；4) 洗涤。加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；5) 染色。弃上清，加入100 l PBS/管涡旋混匀细胞，并根据实验设计，向各流式管中加入相应的荧光素标记抗体，混匀，室温避光孵育30min（操作

2、尽量保持在避光条件下进行。）6) 洗涤。加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；7) 重悬。弃上清，加入0.5ml PBS/管，混匀，上机检测(可选择BD FACSCanto II或BD Accuri C6)。（注：若不能及时上机，应加入4%多聚甲醛固定，并于4避光保存。）8） 试验结果分析。 （注：实验过程中如果进行多色标记，需要调节荧光补偿）。参考值：CD3+60.8-75.4%CD4+29.4-45.8%CD8+18.2-32.8%NK（CD3-CD56+）9.5-23.5%二、上机检测BD FACSCanto II简要操作流程启动流式细胞仪1 打开流式细胞仪电

3、源2 启动计算机，打开软件登录3 确保软件连接到流式细胞仪必要时，点击Cytometer > connect检查液体水平1 启动流式细胞仪后，检查液体水平 低液面水平或者废液桶满都用红色指示。2 如果液流车未自动开启，选择Cytometer > Fluidics Startup。3 当液流启动完成后，点击OK关闭对话框。检查气泡1 在检查完液体水平后，开启流动室门，检查流动室中是否有气泡。2 如果没有看到气泡，进行第5步。如果看到气泡，点击Cytometer > Cleaning Modes > De-gas Flow Cell.3 当完成信息出现后，点击OK。4 如果

4、还可以看到气泡，重复上述操作。注意：如果打开流动室细胞进口门时出现错误信息，通过关闭进口门，并等待30秒关闭该信息。5 当您完成上述操作后，在往下进行之前请先检查激光预热是否已经完成。创建实验1 按照需要，在工作区工具栏中点击相应的按钮来显示浏览器、细胞仪、检测器、工作表、获取控制板和双指数编辑器窗口。2 创建文件夹： A 在浏览器中选择数据库图标，并点击浏览器工具栏上的New Folder。 B 对该文件夹命名。3 选择该文件夹，点击New Experriment来创建一个新实验。4 对该实验进行重命名。5 选择实验级别的细胞仪设置，然后点击Inspector(检测器)中的Parameter

5、s(参数)选项卡。6 按照需要变更，添加或者删除参数。运行样本并记录数据1 将样品管安装到流式细胞仪中并点击Aquire Data(获取数据)。 A 把抽吸臂向左侧推。B 把流式管放置到SIT上，确保试管竖直，并用力向上推试管直到试管完个停止并完个就位。C 把抽吸臂放置到试管下的中心位置。抽吸臂上有3个传感器引脚。试管底部应定位在这些引脚的中心位置内。2 调节FSC和SSC电压以正确显示细胞的散射光特征。3 必要时，点击阈值图标并对FSC阈值进行调节。4 调节P1门仅围绕目的细胞群体。5 调节好后，点击Record Data(记录数据)以记录数据。6 获取停止，取出试管。建立全局工作表1 如果

6、用户参数中启用了Default global worksheet(默认个局工作表)(默认选项)，则全局工作表已经存在。展开全局工作表文件夹来定位和重命名工作表。（注：如果Default global worksheet被禁用，则通过点击浏览器工具栏中的New Global Worksheet(新个局工作表)按钮创建个局工作表。）2 使用设计对话框定义参数标记并指定各个试管要记录的细胞颗粒数。标记会出现在点图轴上和所有的统计结果图中。 A 选择Experiment(实验)>Experiment Layout(实验布局)。 B 在Labels(标签)选项卡中，为试管输入适当的标签。例如，在F

7、ITC域中输入CD3。使用Tab键移动到下一个域。3 在该全局工作表中，创建用预览数据的点图。例如:创建PerCP-Cy5.5对SSC,FITC对APC, FITC对PE, FITC对PE-Cy7和F ITC对APC-Cy7点图。设门通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：PBMC样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在 FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。关机1选择Cytometer(细胞仪)>Fluidics Shutdown(液流关闭)，并遵循所有的提示。2关闭细胞仪电源。3退出BD FACSDiva软件。C6简要操

8、作流程开机1. 打开电脑，上样处放置一管双蒸水2. 打开C6仪器，其自动执行“startup”，时间约5min，期间禁止开盖3. 当软件显示仪器状态为“Cytometer Connected and ready”并亮绿灯时，则可以上样4. （推荐用质控微球上机，FL1-H和FL2-H直方图中必须有八个峰，FL3-H中必须有6-8个峰，即仪器分辨率CV值满足标准）采集样品1. 样品震荡混匀后置于上样二档处2. 设置流速，采样数目或时间或体积3. 点击“Dot Plot”或“Histogram”或“Density Plot”，选择需要的图形4. 点击坐标轴参数，从下拉菜单中选择需要的参数（如：“F

9、L1-A”“FSC-A”）5. 点击“Plot Spec”，选择“linear”或者“log”，设置坐标轴显示范围6. 右击坐标轴参数，选择“Rename Parameters”，进行坐标轴重命名7. 选择“Display”中的“Events Display Settings”，选择显示的细胞数8. 选择样品位置，点击“run”，进行采样9. 取下样品10. 取新的流式细胞管置于上样针处，点击“backflush”，清洗上样针11. 样品命名12. 点击“Zoom In”，放大指定区域，设置阈值。点击“Zoom Out”，返回放大设门1. 在图像下方点击设门工具，圈定指定区域，设置为门2. 点击相应图像上方的“Gate”，选择该图像需要应用的门设置补偿若样本是双荧光或三荧光检测，则实际图像显示中会用到荧光补偿1. 点击“Set Color Compensation”2. 选择需要补偿的荧光参数，输入补偿值，点击“Save & Close”分析统计点击“Statistic”可选择预览选择的样品图形，所有的Plot列表。所有的Plots，Gates以及统计学的列表，从中选择需要显示的信息关机清洗1. 放置一管去离子水，运行2min，清洗时1