植物保护学科前沿论文

1、成绩 中国农业大学 课程论文 论文题目： 分子生物学技术在昆虫分类中的应用课程名称：植物保护学科前沿 任课教师： 彭友良 班级： 植物保护11班 学号： SY13010062 姓名： 卫玉锋 分子生物学技术在昆虫分类中的应用摘要：随着科学技术的发展,生物技术已越来越多地被应用在昆虫分类学研究中。本文概述了核酸序列分析、RAPD、RFLP、分子杂交、SSCP及DSCP等生物技术在昆虫分类研究中的应用情况,并展望了分子生物学技术在昆虫分类研究中的前景。关键词:分子生物学技术;昆虫分类目前,已经定名的昆虫有100多万种,占已知动物的2 /3,但是全世界仍约有90%的昆虫是未知种 1 。随着科学技术的

2、进步以及各个学科的交叉渗透,已有200多年历史的昆虫分类学也获得了极大的发展,特别是现代生物技术的应用更加速了昆虫分类学发展的步伐。长期以来,昆虫分类主要是以外部形态特征为依据。因为外部形态特征较为直观,且容易掌握,而根据昆虫的形态特征作为分类依据在目等分类单元中可以很好的反映物种的分类地位。但是,在小的分类单元,如属、族、种内则不容易确定物种的分类地位,再到种群、生态型则更难确定分类地位。20世纪70年代以来,先后出现了核酸序列分析、随机扩增多态性DNA (RAPD) 、限制性片段长度多态性(RFLP) 、分子杂交技术、单链构象多态性(SSCP)及双链构象多态性(DSCP)技术等多种现代分子

3、生物学技术,极大的促进了昆虫分类学的发展。1 研究及应用现状1.1 核酸序列(线粒体DNA和核糖体DNA)分析技术线粒体DNA为双链闭环分子。昆虫的线粒体DNA大小为15141613 kb,其中含有编码2个核糖体RNA (12S rRNA, 16S rRNA) 、22个t RNA、1个细胞色素b、3个细胞色素氧化酶(CO I、CO II、COIII) 、6个NADH降解酶(ND 16)和2个ATP酶(6和8)的基因 2 。目前,通常用于昆虫分类研究的基因有以下几种: 16S rRNA、细胞色素b、ND2、COI、CO II等。潘兴丽等以线粒体细胞色素b (Cyt b)基因作为分子标记,首次对缘

4、蝽科4亚科14种昆虫进行序列测定,获得Cyt b基因412 bp 的序列片段。以筛豆龟蝽为外群构建系统发育树,表明在亚科级关系上,姬缘蝽亚科最原始,蛛缘蝽亚科次之,巨缘蝽亚科和缘蝽亚科亲缘关系较近3 。姚银花等通过对我国大螟S esam ia inferens 9 个地理种群的线粒体DNA CO II基因的测序,并分析了大螟不同地理种群之间的CO II序列的遗传分歧及相似性,同时建立其系统发育关系4 。核糖体DNA是编码核糖体RNA的基因,是一类中度重复的DNA序列,以串联多拷贝形式存在于染色体DNA 中。每个重复单位由非转录间隔区 (NTS) 、转录间隔区( ITS)和3 种RNA ( 18

5、S、518S、28S RNA)基因编码区组成 5 。由于rDNA是生物界普遍存在的遗传结构,具有多拷贝性、编码区保守、转录间隔区中度保守等优点,因而在个体及群体内有较好的均一性,少量样品能有效代表其来源群体的rDNA的变异情况。因此, rDNA已成为生物系统进化研究中一个非常有用的分子标记6 。Flook和Rowell测定了29 种多新翅类( Polyneop tera)昆虫的18S rDNA 的全序列,并结合Gen2Bank数据库中的8 种其它昆虫的18S rDNA 全序列,重建了传统的古翅亚部( Palaeop tera)和新翅亚部(Neop tera)昆虫的系统发育,其结果支持直翅目的单

6、系性 7 。刘殿锋等人测定了斑腿蝗科(Catantop idae) 10亚科20种蝗虫和其它蝗科3种蝗虫的线粒体16S rDNA 部分序列,并从GenBank中下载了蝗亚目(Locustodea) 15个种的16S rDNA相应序列片段,构建了系统发育树,但分子系统学研究结果和基于形态特征的斑腿蝗科传统分类结果有很大的不同8 。1.2 RAPD 和RFLP技术RAPD技术是由美国杜邦公司的科学家Williams和加利福尼亚生物研究所Welsh两个研究小组在1990发展起来的以PCR为基础的一项DNA分子水平上的大分子多态检测技术 9 。其原理是用随机序列的9 - 10个核苷酸的引物对基因组的D

7、NA进行PCR扩增,再进行电泳分离与溴化乙锭染色。RAPD 技术具有简便、快捷、灵敏、多态性检出率高、所需DNA量少等特点,因此被迅速用于个体和品系鉴定、基因的多态分析、基因定位、构建遗传图谱、标记辅助选择和种间遗传分析等领域的研究。目前RAPD技术已成为昆虫遗传图谱构建中的一种普遍方法,该技术一出现,就被用于蚊虫的分子系统学研究。南宫自艳等采用RAPD技术,分析了5种松毛虫10个地理种群的种群内、种群间的遗传多样性,检测和描述在不同地理环境条件下的松毛虫种群的遗传结构和变异情况,为松毛虫的综合防治提供有效的依据 10 。赵慧婷等采用RAPD 技术对来自中国境内8个省市的28群东方蜜蜂Apis

8、 cerana进行了研究,探讨了它们之间的亲缘关系 11 。RFLP技术(限制性片段长度多态性分析)是由Bostein在1980年首先建立并发展起来的一种分子遗传标记技术。它是指应用限制性内切酶切割不同类群个体基因组DNA或某一基因,产生不同长度的限制性片段,根据酶切图谱,计算类群之间的遗传距离,构建系统树。贾正辉等应用PCR - RFLP技术对来自四川省8个地方的枯死松树样品中的伞滑刃属线虫群体进行了分子鉴定。该研究中选用的4种限制性内切酶(Dra、Sal、Hha、Alu)除Sal外均可对所鉴定的6种伞滑刃属线虫产生特异性的酶切位点,从而均可有效地鉴别出松材线虫、拟松材线虫和其他4种伞滑刃属

9、线虫,其结果可为今后这几种伞滑刃属线虫的分子鉴定提供一定的参照12 。1.3分子杂交技术核酸的分子杂交技术是现代分子生物学研究中常用的方法之一,它和克隆技术密不可分,并且在基因表达、调控以及在物种亲缘关系的研究中具有重要作用。最基本的分子杂交技术包括原位杂交技术、Northern分子杂交技术和Southern分子杂交技术。在昆虫学研究主要应用核酸分子技术检测起遗传的多态性、DNA的同缘性和mRNA的差异来鉴别昆虫的近缘种以及地理种群。分子杂交的关键是制备特异性强和灵敏度高的探针。目前应用较多的是地高辛和生物素等非放射性标记探针。Lorite等利用原位杂交对叶甲科Chrysomelidae昆虫C

10、hrysolinaam ericana的微卫星进行了研究13 。1.4SSCP和DSCP技术SSCP技术(单链构象多态性分析)及DSCP技术(双链构象多态性分析)的基本原理相似,都是依据DNA分子在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,其迁移率除与DNA的长短有关外,更主要的是取决于DNA链所形成的构象。SSCP技术自1989年由Masato Orita等人建立以来,就以其灵敏性广受关注。李石柱等就使用PCR - SSCP技术对我国多斑按蚊复合体5个成员种进行了分子鉴别,分析其28S - D3扩增产物,结果显示电泳条带具种特异性,可用于鉴别各蚊种 14 。DSCP技术在昆虫分类上的应用不多,

11、在国内未见有相关报道。2.问题与展望随着核酸序列分析、RAPD、RFLP、分子杂交、SSCP及DSCP等分子生物学技术在昆虫分类研究中的应用和有益探索,或是解决了传统分类中所存在的学术疑难问题,或是验证了传统分类所得出的结论,已显示出其应有的优势和广阔的发展前景。然而分子生物学技术在昆虫研究中的应用时间毕竟不长,还存在不少问题。首先是目的基因或DNA片段的选择,如何在庞大的昆虫DNA文库中选择最有利于昆虫分类、最能反映其进化关系的基因或DNA片段,仍存在较大难度。其次是用不同的目的基因或DNA片段对同一昆虫进行研究,可能会得到不同的结果。再次是分析软件或程序包的应用,目前有大量的分子生物学分析

12、软件,不同的软件或程序包有许多不同的假设和参数,研究者采用不同的分析软件或采用同一软件而设置不同的参数,同样的数据可能会得到不同的结果。如何解决好这些问题是今后昆虫分类科学研究工作中的重要任务。随着分子生物学技术的迅速发展,实验技术的不断发展和改进,它必然会推动昆虫学在分子水平上的发展。昆虫分类学是昆虫学研究中的基础领域,也是传统领域,可以预见在不远的将来,古老的昆虫研究随着不断创新的理论和技术的发展,将有新的更大的成就。参考文献： 1 袁锋. 研究内容和发展A .昆虫分类学M .北京:中国农业出版社, 1996, 1 6. 2 Flook P K, Rowell C H F, Gelliss

13、en .The sequence, organizationand evolution of the Locusta migratoria mitochondrial genome J JMoEvol, 1995, 41: 928 941. 3 潘兴丽,苏富奎,宋艳红.中国缘蝽科部分种类细胞色素b基因序列及系统进化研究 J .四川动物, 2008, 27 (1) : 21 25. 4 姚银花,杜予州,郑福山等. 大螟不同地理种群CO II基因序列分析 J .环境昆虫学报, 2008, 30 (1) : 39 43. 5 TaulzD, Hancock J M, Webby D A, et al

14、1 Comp lete sequence ofthe rRNA genes of D rosophila m elanogaster J Mol Biol Evol, 1988, 5 (4) : 366 376. 6 成新跃,周红章,张广学.分子生物学技术在昆虫系统学研究中的应用 J 动物分类学报, 2000, 25 (2) : 121 132. 7 Flook P K, Rowell C H F Inferences about orthop teroid phylogenyand molecular evolution from small subunit nuclear ribosoma

15、l DNAsequences J InsectMolecular Biology, 1998, 7 (2) : 163 178. 8刘殿锋,蒋国芳,时号等.应用16S rDNA序列探讨斑腿蝗科的单系性及其亚科的分类地位 J .昆虫学报, 2005, 48 ( 5) : 759- 769. 9 Williams J G K, Kubelik A R. DNA polymorphisms amp lified byarbitrary p rimers are useful as genetic markers J NucAcidsRes, 1990, 18 (22) : 6531 6535. 10南宫自艳,高宝嘉,徐志娥等. 松毛虫属5种松毛虫不同地理种群RAPD遗传多样性分析 J 农业生物技术学报, 2009, 17(1) : 178 179. 11 赵慧婷,高鹏飞,姜玉锁等. 中国东方蜜蜂不同地理种群的RAPD分析 J .动物分类学报1 2008, 33 (1) : 89 96. 12贾正辉,朱天辉,杨佐忠.四川松材线虫与拟松材线虫的PCR- RFLP鉴别 J .四川农业大学学报, 2012, 26 ( 2 ) : 205 -209. 13 Lortie P, Palomeque T, Garner I, et a