【定量数据分析】荧光定量PCR技术_常见问题与解答

1、螺旋课堂第一课荧光定量PCR技术PCR技术的发明极大地推动了分子生物学的发展，而且迅速被推广和应用到生命科学的各个领域，可以说它是目前核酸分子水平的基础及应用研究中使用最广泛的一项技术。常规PCR中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对PCR扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量，如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒DNA/RNA的精确copy数等，如此,荧光定量PCR技术便应运而生。本文将分为三大部分向大家介绍，首先是理论篇：首先了解荧光定量PCR的理论知识，如荧光定量PCR技术

2、的原理、方法等；随后为实践篇：如实验的操作流程、注意事项、方法选择、结果分析与处理等；第三部分为问题分析与解答篇：荧光定量PCR过程中有哪些常见问题，我们如何避免和解决。第一章理论篇一、荧光定量PCR技术发展史1993年，日本Higuchi等人首次采用动态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量PCR技术的概念。当时他使用了EB（澳乙锭）作为荧光标记染料，采用一台经过改良的热循环仪，用UV射线照射样品然后通过CCD相机检测产生的荧光值，利用了PCR反应中的数学函数关系，再结合加入标准品的方法，达到了对检测样品进行准确定量的目的，但由于这种方法由于有着在实验仪器资

3、金上巨大的耗费，一些非特异的PCR产物同样能被检测到并包含在被测的荧光信号值总量之中而导致定量不准确等因素，最终使这种实验技术在当时没能成为主流的实验技术。1995年美国PE公司成功研制了TaqMan技术，1996年又推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用Ct值进行分析，荧光定量PCR才很快得到大家的接受，并广为应用。近年来，荧光定量PCR技术不断完善，取得了突飞猛进的发展。由于其具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点，而被广泛应用于基础科学研究、药物研发、临床诊断、转基因研究、基因检测等各个领域研究当中。二、荧光定量PCR概述1、荧光定量PC

4、R概念所谓定量PCR技术（real-timePCR）,是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法（图1）。图1荧光定量PCR反应原理Icytle荧光检测元件2、荧光定量PCR与普通PCR的主要区别常规PCR中，PCR产物通过凝胶电泳，然后进行成像分析，常规PCR只能通过终点法对扩增产物进行定性分析，而不能进行定量分析（图2）;荧光定量PCR中，PCR反应体系中加入了荧光分子，通过荧光信号的变化来反应扩增产物的变化，使PCR产物的实时检测成为可能。相对常规PCR而言，荧光定量PCR的主要优点使准确地确定初始模版拷贝

5、数和较高的检测灵敏度；荧光定量PCR不仅可用于定性，如判断一段序列的有无，也可用于定量，如确定起始模版的拷贝数;图2终点法定量PCR的缺陷jflhWk.理论上PCR是一中指数增长的过程：但是实际的PCR扩增曲线并不是标至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求,准的用数曲线;而是S形曲饯。这¥因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dTP、弓I物,FPCR的效率越来啊B以后，PCR就进入了晋令期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCRJr，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和反应体系进入年台加的孙机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是

6、96次PCR重复实验，各种条件基本一致，所得结果有很大差异（图2）常规PCR的定量方法，测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系（图2）,所以不能根据最终PCR产物的量直接计算出起始DNA拷贝数。虽然加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。而从图2也可以看出，虽然相同模版在同一台PCR仪上进行96次扩增,终点处检测产物量不恒定，但96次PCR扩增曲线都有一个共同的拐点，即荧光定量PCR中Ct值的重现性，恒定的Ct值为荧光定量PCR的分析提供了理论依据。前面我们对荧光

7、定量PCR的历史、荧光定量PCR概念和与常规PCR区别有了大致的了解，但你可能心中存在许多疑惑：什么是扩增曲线？什么是Ct值？它们有什么特点？我们如何来判定荧光定量PCR反应中的Ct值，原理是什oooooo为了使大家更好的理解、掌握荧光定量PCR技术，在介绍荧光定量PCR检测方法、动力学原理和数据分析方法前，有必要先介绍几个最基本的概念。3.1 3、荧光定量PCR的几个基本概念扩增曲线为了更好的理解荧光定量PCR原理，我将用样品扩增曲蜃来进行说明。描述PCR动态进程的曲线即扩增曲线。PCR的扩增曲纭实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S型曲线（图3）。图3中，X轴表示PCR循环%Y轴表示扩增

8、反应的荧光值，与反应管中扩增产物的量有比例关系。从图3可用艮直观的看出，荧光定量PCR扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,我们可以选择在这个阶段进行定量分析。3.2 荧光阈值在介绍荧光阈值之前，先了解一下荧光本底信号（图3）,我们一般把荧光PCR的前

9、15个循环信号作为荧光本底信号（baseline,基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任n意位置上，荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍（机器自动设置）。我们在做荧光定量PCR实验时，经常采用手动设置，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值（图4）0图4手工调整荧光阈值示意图3.3 Ct值益-了解了荧光抽叱概念后，Ct值就很好理解了。C代表Cycle,t代表thr

10、eshold,所谓Ct值就是在荧光、PCR扩增过程.中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经区的扩增循环次数。如图3所小，黑色的线显示的是荧光阈值，当信号超过黑色线所经历的循杼数即为CfSo从这也可以了解到Ct值是可以变化的，我们实验时带有一定4人为（素。,荧光定量PCR后面的数据处理要用到Ct值来计算，所以有关荧光阈伯设置卜显得尤为重要。一般说来，新手按荧光PCR仪的自动设置为好，加如乂你1常有经验，一般会手动设置荧光阈值。因为Ct值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT值范围在18-3

11、0之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。前面也提到过，同一模板经过96次PCR扩增，扩增产物虽然不恒定，但Ct值极具重现性。根据这个特点，我们可以利用已知起始拷贝数的标准样品的Ct值做出标准曲线，只要在同一次PCR实验中得到未知样品的Ct值，就可以根据曲线算出该未知样品的起始拷贝数。接下来我们就来看看通过Ct值算出拷贝数的数学原理是怎样的：首先我们来回顾一下PCRT增原理（图5）,从PCR原理图中我们也可以很清楚的知道理想的PCR反应是以2n次方增长的方式扩增，即：X=X0>2n但由于PCR反应体系是一个有限的体系，也就是我们加入到PCR反应体系中的物质是有限的，例如酶、引物、Buff

12、er等，只有在对数增长期时，PCR的扩增效率才等于1,大部分时候扩增效率小于一，有时甚至等于零。因此PCR扩增的真正情况是：X=X0(1+Ex)n其中n：扩增反应的循环次数；X：第n次循环后的产物量X。：初始模板量；Ex：扩增效率在扩增产物达到阈值线时所经历的循环数为Ct个循环，航时的产物量为XCt=X0(1+Ex)Ct=M其中XCt：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量，在阈值线设定即它是一个常数，我们设为M,。对方程式两边同时取对数得10gM=logX0(1+Ex)Ct,我们对该方程式做简单的数学运算后得到：logXo=-log(1+Ex)*Ct+logM其中M为常数，Ex为常变数，也就

13、呈说Ex在PCR反应中的某一个循环中是一个常数，但不同的循环数中，fEx的数值会发生变化?因此从上式可以推出：Log浓度与循环数呈线性关系，N据柱品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。DZAHt合峰在丸乐及fPCRJObiAm以”nrrmninrrrnrrrriIII门匚IUlllI口ILinni|川口门iniJBIIIIIIIIIIIIIIIIII,A/Jfl图5PCR原理图.口IL通dLAiDMA*j3.4 标准曲线在绝对定量中，未知样本的量如基因拷贝数可通过梯度稀释的已知量的标准品的Ct值推算出。在实验过程中，我们可以将已知浓度的标准品进行梯度稀释个(56r稀释梯度

14、)，将未知样品和梯度稀释的标准品在同一荧光PCR实验中进行反应，将稀释标准品得到的Ct值构建标准曲线，通过标准曲线可以推算出未知样品的量（图6）。标准曲线的制作不需要人工操作，由仪器自动完成。理论上，一系列稀释样品的扩增曲线之间有均匀的间距（图6左），如果PCR反应呈理想的方式扩增，产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距则符合等式"2n=稀释倍数”，n为2样本问Ct值差。例如：10倍稀释的样本，2n=10,可得n=3.32,Ct值差3.32。图6荧光定量PCR标准曲线示意图3.5 扩增效率«、在绝对定量中，我们将已知模板稀释成一系列浓度梯度进行荧光PCR实验，利用拷贝数和

15、Ct值做成标准曲线，禾拥递减的直线关系等式和相关系数（r）或可信度来计算扩增效率。1-A扩增效率与标准曲线的斜率j关，计4方程为：扩增效率（E）=10-1用率。理论上，在每个指数扩曲循环中，!PCRT物的量加倍，即PCR产物2倍增加，反应效率为2,扩增效率就呐2,就可得2=10-1今.标准曲线彳#斜率就为-3.32,斜率得绝对值与荧光曲线间距相同。如果将扩增效奉用0分率来表示，即:.E%=（E-1）X100%,对于理想的PCR反应lE=2,即：扩增效率E%=（2-1）X100%=100%如果E=1：9&,带入方程（1版-1）X100%=92%,表示每个循环的终点，扩增产物的拷贝数增如&

16、quot;2倍，内每次循环有92%的模板被扩增。一般说来，旷增效率隹近100%是优化的重复性好实验的最好标志，实际操作时，反应的扩增效率应该在90%105%之间，如果扩增效率低，可能的原因是引物设计不当一或者反应条件未优化；扩增效率大于100%时，可能的原因是系列稀释样品加样错误，或者有非特异性产物扩增，如引物二聚体产生。用上述方法确定扩增效率时，反应体系中的抑制剂的出现也可能导致扩增效率明显增加，原因是高浓度模板样本中抑制剂的浓度低，导致反应的Ct值延迟出现，而低浓度模板样本中抑制剂浓度高，反应的Ct值延迟程度小，导致斜率的绝对值以及计算所得的扩增效率会增加。如果扩增效率小于90%或大于10

17、5%,建议重新设计引物或探针。三、荧光定量PCR的方法荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。而荧光定量PCR的方法相应的可分为特异类和非特异类两类，特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核甘酸探针来检测产物；而非特异性检测方法是在在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射出荧光信号。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBRGreenI的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法，在这里主要介绍这2不忘法，其它方法请参考其它荧光定量PCR资料。1、

18、非特异性SYBRGreenI染料法SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料（图7）,在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强（图苟。因此RsYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根"荧光信司检测出,PCR体系存在的双链DNA数量。SYBRGreenI的最大吸收可长约为497nm,发射波长最大约为520nm。热变性引物VV箕光物质TTTT©jFF引物退火DNA聚合酹（FJFkII阴IIIIIIIII延伸反应SYBRGreenI的优点：实验设计简单，仅需要设计上下游

19、一对引物，不需要设计探针，无需设计多个探针即可快速检验多个基因，通用性好；成本低；能够通过溶解曲线分析检验扩增产物的特异性。因而在低通量实验和单重实验时一般优先考虑使用SYBRGreenI染料法SYBRGreenI的缺点：由于SYBRGreenI与所有的双链DNA相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性，SYBRGreenI方法对PCR扩增特异性要求较高。实验过程中通过熔解曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBRGreenI得到定量结果。另外，因为SYBRGreenI不能区分不同扩增子发出的荧光而导致它不能用于多重反应。溶解曲线分析可以用来确定不

20、同的反应产物，包括非特异性产物。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧超号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm,DNA双链解链50%的温度），用这个殖征峰就可以将特异产物？其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的皿溶解、（图9）。图9SYBRGreenI焊曾产物溶解曲线分析律一峰，无非籽岸性产I二经小一"物，定里准确cl"?i-M_«:4iti出现氽峰，存在非杵洋性扩增，定位不僦病2、特异性Taqman水%探针法TaqmaL

21、荧光定重技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核甘酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。从而实现定量。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3'端的淬灭基团接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5'外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光

22、。一分子产物生成伴随一分子荧光信号产生（图10）。随着扩增产物的增加，荧光增强。PCR扩增程序通常将复性与延伸合二为一。常用的荧光基团是FAM,TET,VIC,HEX图10Taqman探针工作原理fi1由于Taqman探针法中，除引物外，还使用了一条特异的探针，因此此方法可以特异的检测目标序列，防止非特异产物的干扰影响定量的准确性，同时它也可以用于多重反应，但探针设计成本较高，有时探针设计困难。第二章实践篇我们在设计实验的时候通常对下列事情更感兴趣：1）测定未知样品的绝对量：如给定的血样中的病毒颗粒数，食品中某一种转基因成分的含量；2）未知样品与已知样品相比，基因的表达量改变了多少倍：如相当量

23、的肿瘤组织和正常组织相比，p53mRN做变了多少倍。分析这两种假设的方法就分别叫绝对定量和相对定量。绝对定量是通过样品的Ct值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中（给定数量的细胞，每微克总RNA）中核酸的量（拷贝数、微克）。相对定量的分析结果是在相当量的试验组（样品A）和对照组（样品B）中一个靶基因的相对比率（倍数差异）。接下来我们就来看看我们在实验过程中如何来使用绝对定量和相对定量的分析方法。一、绝对定量分析1、绝对定量分析方法的使用条件在这里我将举例来说明我们在实验过程中，何种实验需要用绝对定量来进行分析。医生对一个乙肝病人的每毫升血液中HBVDNA的精确拷贝数感兴趣。首

24、先医生要从病人血液中提取DNA,然后通过荧光定量PCR实验来确定HBV病毒DNA的copy数。通过病人样品的Ct值和设置梯度稀释的已知HBV对照样品的标准曲线进行比较，医生就能确定病人血液中HBV病毒DNA的copy数。从这个例子，我们也可以看出，在实验过程中，如果最终的结果是对未知样品的定量描述，并不依赖别的样品的性质的时候，就应该使用绝对定量进行分析。2、引物和探针的设计使用Taqman探针法要同时考虑探针和引物的质量。首先要寻找合适的探针位置，再设计引物，并使引物尽可能靠近探针。2.1 引物设计原则引物的设计大家应该非常清楚了，在这里就不再赘述，但荧光定量PCR引物的设计还是与普通PCR

25、引物设计有所差别和要求。探针设计原则探针位置尽可能地靠近上游引物，扩增片段长度在50-150bp范围内；探针长度通常在20-30bp,Tm值在6570C,通常比引物Tm高5-10C,GC含量在40%70%。探针的5'端应避免使用碱基Go探针内部或探针与2条引物之间避免3个碱基以上的互补序列。整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。3、标准品的制作：3.1 标准品制作流程目的基因PCR扩增目的基因克隆重组质粒筛选梯度稀释计算质粒DNA质粒DNA提取、制作标准品拷贝数重组质

26、粒鉴定.3.2 标准品拷贝数的计算待测样本浓度（ng/ul）=OD260M0淅释倍数样本分子量=碱基数X3243.3 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量6X1014标准品的梯度稀释：1v原液（标准品i）+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v注意：稀释的时候，1v体积不要只加1ul,体积最好加大，如10ul,这样有助于保证标准品稀释是土一的10倍梯度.4、荧光定量PCR模板的制备请查阅DNA/RNA提取、逆转录的相关资料。5、荧光定量PCR体系

27、准备PCR条件摸索：不加探针的常规PCR反应，验证引物是否合适、模板是否降解、模板纯度是否合适。同时确定最佳反应体系和反应条件。由于当前大部分实验为使用mix,所以只用摸索模板、引物条件即可。模板浓度：如果是首次实验，那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验条件摸索，以选择出最合适的模板浓度，条件困难时，也至少要选择两个稀释度（高或中、低浓度）来进行实验。一般而言，Ct值在15-30范围内比较合适，若大于30则应加大模板使用量，如果Ct小于15则应对模板进行稀释后再进行实验。引物的浓度：引物的浓度是一个影响PCR反应的关键因素，若浓度太低，会致使反应不完全，若引物太多，则发生错配以及产生非特异

28、的产物的可能性会大大增加。对于大多数PCR反应，可在0.1-1.0UM之间进行选择，直至得到满意的结果。探针浓度：初次实验每个探针用0.2uM,如果信号强度达不到要求，可以适当增加至0.4uM将已知浓度的HBV阳性标准品做系列浓度稀释，分别含有5X103、5X104、5X105、5X106copies/m|建立20ul反应体系（参照优化体£）,3次重复（荧光PCR一般进行3次以上重复，有的甚至达到了6次以上重复）。以某病人的血液提取的HBV病毒DNA为模板，建立20ul荧光处吹PCR反应体系（参照优化体系），每个样品3次重复，同时设置不加模板的阴，N照。6、荧光定量PCR体系配制及仪

29、器程序设置请参照各公司荧光定量PCR试剂、荧光定量PCR仪器说明书进行。7、实验结果与数据处理一JrPCR反应结束后，得到如下数据：copies/mlCt1Ct24MeanCt5X10327.61.27.58/(27.8427.676675X10424.2524.4224.5524.406675X10521.1121.0421.1621.103335X10618.0518.0618.2118.10667BLANKNoneNoneNone-iSTD0.130.080.060.08注：平行样的Ct：叱间的差0.51用表示重复性较好0.05(slope)o相关sample23.2523.4623.3

30、923.36667系数反映标准曲线的直线性，理想值应大于0.98,越接近1说明直线性越好，定量越准确。斜率反映PCIT增效率（E）,理想的PCIT增效率在90%105%之问，如果PCfT增效率低，必须重新设计引物或探针；如果扩增效率高于理想值，可能是系列稀释样品加样错误，或者非特异性产物扩增，或反应体系中可能存在着对反转录反应或PC岐应阻害的物质，需要相应的解决办法。从标准曲线可以看出：r2=0.9995,大于0.98,标准差都在0.2范围内，而E=101/-3.2013=2.04,扩增效率=（2.04-1）X100%=104%,表示定量准确，可将未知样品的Ct值带入方程：23.36667=-

31、3.2013X+30.827可得X=2.33所以copies=（5X104/2）乂2.33=5.825x104但我们需要注意的是，标准曲线只可能用于推算稀释梯度范围内的未知样本的量，而不能外推稀释梯度外的未知样本的含量。所以，我们在实验过程中尽可能使未知样品的浓度在标准品的稀释范围内。二、相对定量分析1、相对定量分析方法的使用条件同绝对定量分析类似，我将举例来说明我们在实验过程中何种实验需要用相对定量来进行分析。我们如果想知道经过药物处理过的组织和未处理的组织中某一目的基因的表达水平是否有差异，相差多少倍？我们可以选择以下2种方式：1）我们可以从等量的2种组织中提取RNA,分别进行目的基因的反

32、转录特异性荧光定量PCR实验来确定目的基因在2种组织中的表达量，结果可以反映等量的2种组织中目的基因表达量的比率。2）如果我们之前已经确定2种组织中看家基因如GAPDH的表达量相等，那么，我们就可以从大约等量（不需要等量）的2种组织中分别提取RNA,通过RT-qPCR实验来确定2种组织中目的基因和看见基因的表达水平。药物处理组织的目的基因的表达量可由2种组织中看家基因和未处理组织中目的基因的表达量共同来确定。2种分析方法的差异就在于用的标准有所不同，方法1）中的标准是2种组织的量相等；方法2）中的标准是2种组织中看家基因如GAPDH的表达量恒定不变；2、相对定量数据处理方法：对于不同的实验需求

33、，我们可以采用不同的方法进行实验设计和数据分析，一般常用的方法有双标准曲线法、Ct、2-MCt、用参照基因的Ct法和Pfaffi法，应用每种方法都有适应条件。如为检测A基因在某因子干预下的表达，我们得到一组数据见下表：待测基因（Ct值）参照基因（Ct值）待测基因扩增效率（E）参照基因扩增效率（E）干预前ABCD干预后EFCD根据实验要求我们可以选择相应的方法，如下表:数据处理方法经巧条件计算方法Ct法扩增效率为100%,仅需目标基因即可表达水平=2-Ct=24）目的基因和参照基因打增效率都接近100%,且相AACt表达水平=2-=2-(E-F)-(A-B)表达水平=2(f-b)-(e-a)表达

34、水平=c(a-e)/d(f-b)对偏差不超过|5%,需要目标基因和参照基因。|参照基因的CtPfaffi法同2目标基因和参照基因打增效率不同，但目标基因间的扩增效率相同，需目标基因和参照基因，以及扩增效率。而目前相对定量普遍采用操作简便的2一"Ct分析方法，下面就以此分析方法为例进行分析，应用SYBRGreen方法对不同样本问X基因表达分析的详启明和举例。3、引物的设计在这里不再赘述，但需要提醒大家再设计扩增片段长度时，最好在100-200bp范围内，在这范围内，扩增片段越短，有效扩增反应越容易实现，同时较短的扩增片段也可保证分析的一致性。4、模板的制备请查阅DNA/RNA提取、逆转

35、录的相关资料。5、PCR体系准备PCR条件摸索：同绝对定量分析条件摸索，只是值得注意的是由于SYBR染料法对引物要求要比探针法高，在荧光定量实验前，我们可通过普通PCR实验来评价引物质量。以RT-PCR获得的cDNA为模板，建立20ul荧光定量PCR反应体系，每个样品6次重复（药物处理和未处理）,对X基因和GAPDH基因进行扩增，同时设置不加模板的阴性对照。6、荧光定量PCR体系配制及仪器程序设置请参照各公司荧光定量PCR试剂、荧光定量PCR仪器说明书进行。7、实验结果与数据处理7.1 溶解曲线绘制与分析SYBRGreen染料没有序列特异性，可以结合到包括非特异产物和引物二聚体在内的任何dsD

36、NA上，因此有必要区分目标信号和假信号。内嵌染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解，称为溶解曲线分析。在溶解曲线分析过程中，随着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点，实时仪器连续监测每个样品的荧光值。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链，可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰。溶解峰反映了反应中扩增到的产物。这些峰与凝胶电泳中条带类似。熔解曲线的设置是在整个PCR完成后进行，从60c升至95C,每升高1C仪器会自动收集荧光信号，得到的熔解曲线是逐渐下降的过程，且在Tm值下降最快，为方便分析，我们将温度与荧光强度的变化求

37、导，即得到单峰的熔解曲线，这样我们就可以证明引物的特异性良好，实验结果不受非特异性扩增和引物二聚体的干扰。7.2数据处理样品未处理样品药物处理样品BLANKCt值MeanCt6.1820.124.06NNonefNone24.18120.34基因MeanftGAPDHCt2-"Ct26.52-2.124.35下面我们来看看上面表格中差异倍数是如何得来的：首先，分别求出6个重复样品X基因和GAPDH基因平均Ct值后，应用参照基因GAPDH对未处理样品和药物处理样品进行校正： Ct（未处理样品）=X基因MeanCt值一GAPDH基因MeanCt值=26.5220.34=6.18 Ct（药

38、物处理样品）=X基因MeanCt值一GAPDH基因MeanCt值=24.1820.12=4.06然后，对未处理样品和药物处理样品的Ct进行归一化:Ct=zCt（药物处理样品）-ACt（未处理样品）=4.06-6.18=-2.12最后，我们就可以根据Ct算出药物处理样品与未处理样品问X基因的表达差异:2-Ct=2（2.12）=4.35量达表对相未处理样品:药物处理样品一样品名称翼因此药物处理样本的X基因的表达水平是未处理样品的14.35倍此结果是通过参照基因表达水平校正的待测样本中的目标基因相对于校准样本，用参照基因校准目标基因表达的目的是弥补样本组织量的差异。为了更直观的表示样品间的表达差异，

39、最后我们可以将计算得到的相对量用图表来表示，如下图：<K54.543.532.521.510.50。法的修工如果目标基因可蓊照基因有相同的扩平效率，但扩增效率不等于2,那么,广C法的公式可以修房用家际扩增效率.代替等式中的2。例如，如果目标基因后参照基因的,增效率都汇上1.98,计算公式可以修正为1.98-"Ct。第三章常见问题与解答篇一、无Ct值（信号）出现1、反应循环数不够：一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号；2、检测荧光信号的步骤有误：一般采用72c延伸时采集荧光，Taqman方法则一般在退火结束或延伸结束采集信号；3、引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；4、探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸；5、模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起；6、模板降解：避免样