植物原生质体组织培养

1、第七章第七章 植物原生质体的分离与培养植物原生质体的分离与培养 7.1原生质体培养的意义及分离技术原生质体培养的意义及分离技术原生质体制备原生质体制备 7.2原生质体的培养与植株再生，原生质体的融合及体细原生质体的培养与植株再生，原生质体的融合及体细 胞杂种的鉴定与筛选胞杂种的鉴定与筛选植物原生质体培养和细胞融合原生质体的分离与培养原生质体的分离与培养概念及研究进展概念及研究进展原生质体融合原生质体融合原生质体原生质体(protoplast)：脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球 原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。v亚原生质

2、体亚原生质体(subprotoplast) 在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的减少而形成的一在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的减少而形成的一些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。v核质体核质体(nuclearplast) 由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体。小原生质体。v胞质体胞质体(cytoplast) 不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。第一节第一节 原生质体培养的意义及

3、分离技术原生质体培养的意义及分离技术Protoplast system Organogenesis Regenerative abilityOntogenic processes Cell differentiation Somatic genetics Cell physiology Cell cloning Organelle,DNA uptake Cell fusion 应应 用用v 植物细胞育种中的核质替换植物细胞育种中的核质替换v 细胞质杂种的获得细胞质杂种的获得v 远缘杂交创造新物种细胞远缘杂交创造新物种细胞v 细胞器的互作研究细胞器的互作研究意意 义义植物原生质体的分离和培养植物

4、原生质体的分离和培养v材料预处理材料预处理v原生质体分离的方法原生质体分离的方法v原生质体纯化原生质体纯化v原生质体活力测定原生质体活力测定v影响原生质体数量和活力的因素影响原生质体数量和活力的因素v原生质体培养方法原生质体培养方法v影响原生质体培养的因素影响原生质体培养的因素v原生质体再生过程原生质体再生过程Flash用于分离原生质体的材料用于分离原生质体的材料材料预处理材料预处理用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。些材料原生质体的产量和活力。 龙胆试管苗的叶片用龙胆试管苗的叶片用44处理较好。处理较

5、好。 甘蔗植株必须先在黑暗下培养甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h12h后分离的原生质体才后分离的原生质体才能分裂。能分裂。 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h48h后分离原生质体，后分离原生质体，才能获得高产量。才能获得高产量。原生质体分离的方法原生质体分离的方法酶酶 解解 分分 离离 法法机械分机械分 离离 法法机械分离法机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。

6、伤口处可释放出完整的原生质体。v缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。限制。v优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。破坏作用。酶解分离法酶解分离法： 指将材料放入能降解细胞壁的混合指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。v常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、

7、常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶崩溃酶Driselase）、果胶酶类（果胶酶和离析酶）、果胶酶类（果胶酶和离析酶Macerozyme）、蜗牛酶和胼胝质酶。）、蜗牛酶和胼胝质酶。酶酶来源来源生产厂家生产厂家纤维素酶类纤维素酶类Onozuka R-10绿色木霉绿色木霉Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, JapanCellulysin绿色木霉绿色木霉Calbiochem.,San Diego,CA 92037, USADriselaseIrpex lutensKayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo,Japan酶酶来源来源生产厂家生产

8、厂家果胶酶类果胶酶类Macerozyme R-10根霉根霉Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, JapanPectinase黑曲霉黑曲霉Sigma Chemical Co.Pectolyase Y-23黑曲霉黑曲霉Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan半纤维素酶半纤维素酶RhozymeHP-150黑曲霉黑曲霉Rohm and Hass Co., Rhiladelphia, UAS酶解法的优缺点酶解法的优缺点v优点：获得量大，适用广泛。优点：获得量大，适用广泛。v缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶

9、、过氧化物酶以及酚类物质。过氧化物酶以及酚类物质。会影响所获原生质体的活力。会影响所获原生质体的活力。沉沉 降降 法法漂漂 浮浮 法法不不 连连 续续 梯梯 度度 法法原生质体纯化的方法原生质体纯化的方法飘浮法飘浮法Protoplastv采用比原生质体密度大的高渗溶液采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、（蔗糖、Percoll、Ficoll），）， 使原生使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。质体漂浮在液体表层的纯化方法。v优点：优点：可以避免分离的原生质体因震荡被可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损。组织碎片撞击而破损。 所用药品简单，成本低。所用药品简单，成本低。v缺点及补救措施

10、：缺点及补救措施：对离心力要求比较严格，掌握不好，对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。可采用不同浓原生质体则不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。度和不同离心速度分次漂浮的方法。沉沉 降降 法法v利用比重原理，在具有一定渗透压的溶利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。净完整的原生质体沉积于试管底部。v优缺点：优缺点： 纯化原生质体比较简单。纯化原生质体比较简单。 由于原生质体沉积于试管底部，造成相互由于原生质体沉积于试管底部，造成相互 挤压，常引起原生质体的破碎。挤压

11、，常引起原生质体的破碎。v又称界面法，采用两又称界面法，采用两种密度不同的溶液形种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过成不连续梯度，通过离心使原生质体与破离心使原生质体与破损细胞分别处于不同损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原液相中，从而纯化原生质体的方法。生质体的方法。v优点：可以收集到数优点：可以收集到数量较大的纯净原生质量较大的纯净原生质体，同时避免收集过体，同时避免收集过程中原生质体因相互程中原生质体因相互挤压而破碎。挤压而破碎。12mL碎片带碎片带含原生含原生质体带质体带0.6mL 0.45M蔗糖蔗糖0.45M甘露醇甘露醇不连续梯度法不连续梯度法原原 生生 质质 体体 鉴鉴 定定v低渗

12、爆破法低渗爆破法v荧光增白剂法荧光增白剂法(calcoflower white 0.1%)原原 生生 质质 体体 活活 力力 测测 定定v形态识别形态识别 形态完整、富含形态完整、富含细胞质、颜色新细胞质、颜色新鲜的正常球形，鲜的正常球形，放入低渗溶液中，放入低渗溶液中，可正常膨大。可正常膨大。原原 生生 质质 体体 活活 力力 测测 定定v荧光显微镜识别荧光显微镜识别(FDA法法) FDA (fluorescein diacetate) 本身不发荧光也不具有本身不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内质膜。活细胞内FDA可可以被酯酶裂解，将能发以被酯酶裂解，将能

13、发荧光的极性部分释放出荧光的极性部分释放出来。荧光素则不能自由来。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活穿越质膜，在完整的活细胞内积累细胞内积累。使用浓度：使用浓度：0 0.01%01%原原 生生 质质 体体 活活 力力 测测 定定v酚藏花红染色法（酚藏花红染色法（0.1%) )酚藏花红能使无活力的原酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。的原生质体不着色。v伊凡蓝伊凡蓝(Evans blue)染色法染色法( (0.025%) )有活力但受损伤的细胞和死细胞能有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。够摄取这种染料，活细胞不摄取。影响

14、原生质体数量和活力的因素影响原生质体数量和活力的因素v供试材料及预处理方法供试材料及预处理方法v酶解条件：酶解条件：酶质量、组合、浓度、酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度、光照和温度v渗透压稳定剂渗透压稳定剂v质膜稳定剂质膜稳定剂v分离条件：分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续时间。时间。v分离用具分离用具 酶的种类、组合、浓度酶的种类、组合、浓度材料材料纤维纤维素酶素酶半纤半纤维素维素酶酶崩崩溃溃酶酶果果胶胶酶酶离析离析酶酶蜗蜗牛牛酶酶研究者研究者烟草叶片烟草叶片禾谷类叶片禾谷类叶片油菜花粉油菜花粉马铃薯子叶马铃薯子叶马铃薯花粉马铃

15、薯花粉1.02.01.01.01.00.51.00.10.20.50.51.0UchimiyaUchimiyaScottScott李仕琼李仕琼戴朝曦戴朝曦王蒂王蒂几种草本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度几种草本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%)材料材料纤维纤维素酶素酶半纤半纤维素维素酶酶崩溃崩溃酶酶果胶酶果胶酶离离析析酶酶研究者研究者枸杞愈伤组织枸杞愈伤组织檀香幼叶檀香幼叶檀香愈伤组织檀香愈伤组织榆幼叶榆幼叶山毛榉幼叶山毛榉幼叶胡杨悬浮细胞胡杨悬浮细胞0.52.01.00.10.21.00.50.50.50.20.50.050.50.50.010.030.11.00.20.50.5孙勇

16、如等孙勇如等LakshmiLakshmiLakshmiLakshmiDorinDorinAhujaAhuja诸葛强诸葛强几种木本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度几种木本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%)pHpHv分离原生质体时，酶液的分离原生质体时，酶液的pH值是值得注意的值是值得注意的问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH值是不一致的。值是不一致的。v如制备菜豆叶片原生质体时：如制备菜豆叶片原生质体时： 低低pH（40%40%）交变电场的振幅频率交变电场的振幅频率100 V/cm交变电场处理时间交变电场处理时间20s直流高频直流高频电压电压110

17、0V/cm脉冲宽度脉冲宽度60us脉冲次数脉冲次数1融融 合合 类类 型型v自发融合自发融合v诱发融合诱发融合v对称融合对称融合v非对称融合非对称融合 核失活核失活细胞质失活细胞质失活FlashFlash影响原生质体融合的因素影响原生质体融合的因素v原生质体质量至关重要，高质量的原生质体是细胞融合的首原生质体质量至关重要，高质量的原生质体是细胞融合的首要条件。要条件。v融合方法融合方法v融合参数，包括各种融合液都应选择适当。融合参数，包括各种融合液都应选择适当。融融 合合 体体 类类 型型v异核体异核体(heterokaryon)或异核细胞或异核细胞基因型不同的原生质体融合成杂交细胞基因型不同

18、的原生质体融合成杂交细胞 v同核体同核体(homokaryon)基因型相同的原生质体融合成的杂交细胞基因型相同的原生质体融合成的杂交细胞 v非对称杂种或细胞质杂种非对称杂种或细胞质杂种(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物体细胞杂交植物体细胞杂交标志标志去壁去壁细胞质工程细胞质工程(cytoplasmic engineering)v细胞质工程细胞质工程 又称细胞拆合工程又称细胞拆合工程是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。v可用于研究细胞核与细胞质的关系的

19、基础研究和育种工作。可用于研究细胞核与细胞质的关系的基础研究和育种工作。 细胞质工程细胞质工程v细胞质杂种细胞质杂种应用细胞融合技术，使两种来源不同的核应用细胞融合技术，使两种来源不同的核外遗传物质与一个特定的核基因组结合在外遗传物质与一个特定的核基因组结合在一起一起细胞质杂种获得途径（细胞质杂种获得途径（4条）：条）：v一个正常原生质体与一个去核原生质体融合；一个正常原生质体与一个去核原生质体融合；Lorz等（等（1981）用密度梯度离心（）用密度梯度离心（550% Percoll，2000040000g，4090min）获得高纯度的去核原生质体。）获得高纯度的去核原生质体。细胞质工程细胞质

20、工程v细胞质杂种获得途径细胞质杂种获得途径一个正常原生质体和一个核失活原生质体融合一个正常原生质体和一个核失活原生质体融合v使核失活的方法：使核失活的方法：X射线，碘乙酰胺，罗丹明射线，碘乙酰胺，罗丹明异核体形成后，两个核中有一个消失；异核体形成后，两个核中有一个消失；较晚时期，染色体选择性消失。较晚时期，染色体选择性消失。体细胞杂种产生的其它途径体细胞杂种产生的其它途径v细胞器移植细胞器移植叶绿体移植叶绿体移植v叶绿体的来源叶绿体的来源叶片机械法低速离心叶片机械法低速离心原生质体低渗涨破低速离心原生质体低渗涨破低速离心v叶绿体的纯化叶绿体的纯化 Percoll或蔗糖密度梯度离心或蔗糖密度梯度

21、离心v叶绿体的转移叶绿体的转移 夹层离心法和夹层离心法和PEG诱导融合诱导融合应用应用PEG诱导胡萝卜原生质体摄入藻类叶绿体诱导胡萝卜原生质体摄入藻类叶绿体利用叶绿体的转移使低光效作物的原生质体通过利用叶绿体的转移使低光效作物的原生质体通过摄取高光效作物的叶绿体而提高其光合效率。摄取高光效作物的叶绿体而提高其光合效率。v细胞器移植细胞器移植细胞核移植细胞核移植v细胞核的来源细胞核的来源植物组织机械法植物组织机械法（加（加Triton X-100）过滤离心过滤离心原生质体低渗涨破原生质体低渗涨破(加加Triton X-100)过滤离心过滤离心v细胞核的纯化细胞核的纯化 Percoll或蔗糖密度梯

22、度离心或蔗糖密度梯度离心v细胞核的转移细胞核的转移 夹层离心法：原生质体核原生质体核夹层离心法：原生质体核原生质体核 PEG诱导诱导 电场诱导和微注射电场诱导和微注射体细胞杂种产生的其它途径体细胞杂种产生的其它途径体细胞杂种产生的其它途径体细胞杂种产生的其它途径v微生物移植微生物移植内吞作用内吞作用摄入固氮根瘤菌摄入固氮根瘤菌v外源染色体和外源染色体和DNA的的摄入摄入染色体分离染色体分离v细胞同步化处理原生质体涨破差速离细胞同步化处理原生质体涨破差速离心（心（200 g,10 min200 g,10 min；1000g1000g，20 min20 min）转移方法转移方法vPEGPEG诱导，

23、显微注射诱导，显微注射v农杆菌介导，基因抢，电穿孔，超声波，激光穿孔农杆菌介导，基因抢，电穿孔，超声波，激光穿孔体细胞杂种选择及杂种植株鉴定体细胞杂种选择及杂种植株鉴定v根据可见标记性状根据可见标记性状的的机械选择法机械选择法体细胞杂种选择及杂种植株鉴定体细胞杂种选择及杂种植株鉴定。 FITC( FITC(异硫氰酸异硫氰酸荧光素荧光素) )在荧光显在荧光显徽镜下呈绿色徽镜下呈绿色 RITC ( RITC (异硫氰酸异硫氰酸罗丹明罗丹明) ) RITCRITC在荧在荧光显徽镜下呈红色光显徽镜下呈红色体细胞杂种选择及杂种植株鉴定体细胞杂种选择及杂种植株鉴定v根据其遗传和生理生化特性的根据其遗传和生

24、理生化特性的互补选择互补选择法法互补选择法互补选择法v互补选择法互补选择法是指利用两个亲本具有不同遗传是指利用两个亲本具有不同遗传和生理特性和生理特性, ,在特定培养条件下在特定培养条件下, ,只有发生互只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。抗性互补选择法抗性互补选择法营养代谢互补选择法营养代谢互补选择法生长互补生长互补选择法选择法矮牵牛矮牵牛+爬山虎融合体的选择爬山虎融合体的选择原生质体原生质体矮牵牛矮牵牛爬山虎冠瘿爬山虎冠瘿混合体混合体融合处理融合处理矮牵牛矮牵牛+爬山虎爬山虎细胞团细胞团愈伤组织愈伤组织（异核体）（异核体）NTNT培养基培养基M

25、SMS培养基培养基( (无激素无激素) )NTNT培养基培养基NTNT培养基培养基细细 胞胞 团团MSMS培养基培养基(无激素无激素)死亡死亡MSMS培养基培养基(有激素有激素)愈伤组织愈伤组织原生质体原生质体细胞团细胞团MSMS培养基培养基( (无激素无激素) )死亡死亡愈伤组织愈伤组织体细胞杂种选择及杂种植株鉴定体细胞杂种选择及杂种植株鉴定v细胞学鉴定细胞学鉴定利用染色体显带技术，以亲本染色体为对利用染色体显带技术，以亲本染色体为对照，对细胞杂种的染色体数目、形态和照，对细胞杂种的染色体数目、形态和带带型型进行观察。进行观察。体细胞杂种选择及杂种植株鉴定体细胞杂种选择及杂种植株鉴定v同功酶

26、鉴定同功酶鉴定根据亲本和杂种同根据亲本和杂种同功酶谱的差异来鉴功酶谱的差异来鉴别杂种。有的呈双别杂种。有的呈双亲谱带的总和、有亲谱带的总和、有的出现新谱带或丢的出现新谱带或丢失部分亲本谱带。失部分亲本谱带。常用的鉴定酶为：常用的鉴定酶为：乙醇脱氢酶、乳酸乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、过氧化物脱氢酶、过氧化物酶、酯酶等。酶、酯酶等。体细胞杂种选择及杂种植株鉴定体细胞杂种选择及杂种植株鉴定vDNA分子标记鉴定分子标记鉴定是在是在DNA水平上对水平上对亲本和杂种植株遗亲本和杂种植株遗传差异进行鉴定的传差异进行鉴定的一种技术。一种技术。依据依据DNA的多态性的多态性（polymorphism）Random

27、Amplified Polymorphic DNA体细胞杂种选择及杂种植株鉴定体细胞杂种选择及杂种植株鉴定 主要原因：主要原因： 生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的调控、相互影响的，所以马铃薯，所以马铃薯番茄杂交植株的番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到物质的表达受到相互干扰相互干扰，不能不能再像马铃薯或番茄再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样植株中的遗传物质一样有序表达有序表达，杂交植株不能地，杂交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。 为什么为什么“番茄番茄马铃薯马铃薯”超级杂种植株没有如科超级杂种植株没