第16章紫外-可见分光光度法

1、紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法 第第 16 章章Visible Spectrophotometry and Ultraviolet Spectrophotometry内容提要内容提要:2.分光光度法的基本原理分光光度法的基本原理 透光率与吸光度透光率与吸光度 朗伯朗伯-比尔定律比尔定律 1.物质的吸收光谱物质的吸收光谱 物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收 物质的吸收光谱物质的吸收光谱4.提高测量灵敏度与准确度的方法提高测量灵敏度与准确度的方法 分光光度法的误差分光光度法的误差 提高测量灵敏度与准确度的方法提高测量灵敏度与准确度的方法3.紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法

2、分光光度计分光光度计 定量分析方法定量分析方法 5.紫外分光光度法应用简介紫外分光光度法应用简介 752型分光光度计型分光光度计 紫外分光光度法的应用紫外分光光度法的应用 重点：难点：1.朗伯朗伯-比尔定律比尔定律 2.物质的吸收光谱物质的吸收光谱物质的吸收光谱物质的吸收光谱第一节第一节 物质的吸收光谱物质的吸收光谱一、物质对光的选择性吸收一、物质对光的选择性吸收 M(基态基态) + h M*(激发激发态态) 物质对光的吸收具有选择物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了某性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。的互补光。白白红红橙橙黄黄绿

3、绿蓝绿蓝绿蓝蓝绿蓝绿蓝紫紫二、物质的吸收光谱二、物质的吸收光谱吸光度吸光度A(absorbance) :溶液对一溶液对一定波长光的吸收程度。定波长光的吸收程度。吸收曲线或吸收光谱吸收曲线或吸收光谱:以吸光度以吸光度A对对波长波长 作图所得曲线。作图所得曲线。 max :吸收光谱中，吸光度最大处的吸收光谱中，吸光度最大处的波长。波长。 max是是定性鉴别定性鉴别物质的基础，物质的基础，不同浓度的溶液，不同浓度的溶液， max不变，浓度与不变，浓度与峰值成正比，这是进行峰值成正比，这是进行定量分析定量分析的依的依据。据。 n图图16-1三三(邻二氮菲邻二氮菲)合铁合铁(II)离子的吸收离子的吸收光

4、谱图光谱图 max=508nm图图16-2 不同物质不同物质(A,B,C)和不和不同浓度同浓度(1, 2, 3, 4)的同一物质的同一物质(B)的吸收光谱的吸收光谱(浓度浓度: 1 2 3 4) 注意：注意：1.同物质的溶液，同物质的溶液，不仅其光吸收曲不仅其光吸收曲线形状有差别，线形状有差别，最大吸收波长也最大吸收波长也不同。不同。 2.最大吸收波长与最大吸收波长与物质的浓度无关，物质的浓度无关，是定性分析的依是定性分析的依据。据。 三三 对于有机物来说，能吸收光子产生电子跃迁的对于有机物来说，能吸收光子产生电子跃迁的电子有电子有电子、电子、电子（即价电子）和电子（即价电子）和n电子（即非电

5、子（即非键电子）等三种。当有机化合物吸收紫外或可见光键电子）等三种。当有机化合物吸收紫外或可见光时，这些电子将跃迁到较高的能级状态。故能发生时，这些电子将跃迁到较高的能级状态。故能发生的跃迁有的跃迁有*、n*、n*和和*等四种类型。等四种类型。图图16-3表示了这四种电子跃迁和相应的跃迁能级。表示了这四种电子跃迁和相应的跃迁能级。 1. *跃迁：跃迁： 饱和烃（甲烷，乙烷） E很高， n * * n *图图16-3 分子中电子分子中电子能级和跃迁能级和跃迁 注：注：紫外光谱电子跃迁类型 ： n *跃迁 *跃迁 饱和化合物无紫外吸收 电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系根据分子结构推测可能

6、产生的电子跃迁类型；根据吸收谱带波长和电子跃迁类型 推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）第二节第二节 分光光度法基本原理分光光度法基本原理一、透光一、透光率率 (transmittance)和吸光度和吸光度 I0 = Ia + It + IrI0-入射光强度入射光强度 It-透过光强度透过光强度Ia-吸收光强度吸收光强度Ir-反射损失反射损失Ir 吸收池材料和厚度相同，被测溶液吸收池材料和厚度相同，被测溶液和参比溶液的和参比溶液的Ir影响相互抵消：影响相互抵消： 一般一般Ir很小：很小： I0 = Ia + It 吸收光谱中，用吸收光谱中，用I表示表示透过光强度透过光强度 透光率透光率T：

7、 It T = I0t0lglgII=T-=AA ：吸光度吸光度二、二、Lambert-Beer定律定律 Lambert-Beer定律：定律： A = k b c K-吸光系数吸光系数 b-吸光液层的厚度吸光液层的厚度(光程光程)， cm c-吸光物质的浓度，吸光物质的浓度， g L-1, mol L-1吸光系数吸光系数(K)入射光波长入射光波长物质的性质物质的性质温度温度与浓度无关，只是符号、取值与浓度与浓度无关，只是符号、取值与浓度的单位相关的单位相关c：mol L-1K 摩尔吸光系数，摩尔吸光系数，L mol 1 cm -1c：g L-1K a质量吸光系数，质量吸光系数， L g 1 c

8、m -1Ab cAa b c吸光系数吸光系数 = aMB%11%111 .010cmcmEME吸光系数可用比吸光系数吸光系数可用比吸光系数E1cm 1%表示表示比吸光系数比吸光系数:一定波长时，溶液的浓度为一定波长时，溶液的浓度为1%(g/ml)，厚度为，厚度为1cm吸光度吸光度，E1cm1%与与 和和a的关系分别为：的关系分别为：例 溶液中铁()浓度为5.010-4 gL-1的，与1,10-邻二氮杂菲反应，生成橙红色络合物，该络合物在波长508 nm，比色皿厚度为2cm时，测得A=0.190 。计算1,10-邻二氮杂菲亚铁的a及。(已知铁的相对原子质量为55.85)解：根据比耳定律：A =

9、a b c -1-1-410.190acm5.0 10 g L2cm190 L gAcb-1-14-1-11cm1.1 10molcma190 L g55.85g molML例题例题11-2 某试液显色后用某试液显色后用2.0 cm吸收池测定时吸收池测定时T50.0 %，若用若用1.0 cm或或5.0 cm吸收池测定，吸收池测定，T及及A各为多少？各为多少？应用应用Lambert-Beer定律时，需注意以下几点：定律时，需注意以下几点： 1、Lambert-Beer定律仅适用于单一波长的单色光。定律仅适用于单一波长的单色光。入射光的波长范围越宽，则测定结果越容易偏离入射光的波长范围越宽，则测定

10、结果越容易偏离Lambert-Beer定律。定律。 2、吸收过程中各物质间无相互作用，但各物质的、吸收过程中各物质间无相互作用，但各物质的吸光度具有加和性。即吸光度具有加和性。即 A = Aa+ Ab + Ac + 3、入射光波长不同时，、入射光波长不同时， 也不同。也不同。 越大，溶液对入越大，溶液对入射光的吸收越强，测定的灵敏度越高。射光的吸收越强，测定的灵敏度越高。 4、分光光度法仅适用于微量组分的测定。、分光光度法仅适用于微量组分的测定。n例例13-2：测试酶与腺苷酸：测试酶与腺苷酸(AMP)体系的吸光体系的吸光度如下：度如下：A(280nm) = 0.46， A(260nm) = 0

11、.58，试试计算每一组分的浓度。计算每一组分的浓度。n 已知：酶的已知：酶的 (280nm) = 2.96 104L mol-1 cm-1n (260nm) = 1.52 104L mol-1 cm-1n AMP的的 (280nm) = 2.4 103L mol-1 cm-1n (260nm) = 1.5 104L mol-1 cm-1n 吸收池厚度为吸收池厚度为1.00cm。 n解：设酶和解：设酶和AMP的浓度分别为的浓度分别为y和和z：n 为为260nm时：时： n 0.58 = 1.52 104 1.00y + 1.5 104 1.00zn 为为280nm时：时： n 0.46 = 2.

12、96 104 1.00y + 2.4 103 1.00zn 解方程得：解方程得：y = 1.4 10-5（mol L1） n z = 2.5 10-5（mol L-1）n即：即： 酶的浓度为酶的浓度为1.4 10-5 mol L1，n AMP的浓度为的浓度为2.5 10-5 mol L-1 。 第三节 可见分光光度法 n一、分光光度计一、分光光度计 (spectrophotomete )n主要部件：主要部件： 光源光源 单色器单色器 检测器检测器 吸收池吸收池 指示指示器器光光 源：钨灯，发出源：钨灯，发出3203200nm的连续光谱。的连续光谱。单色器：以棱镜或光栅分光，提供单色光。单色器：

13、以棱镜或光栅分光，提供单色光。吸收池：分光光度计中用来盛放溶液的容器。吸收池：分光光度计中用来盛放溶液的容器。检测器：将通过吸收池的光转换为光电流，再检测器：将通过吸收池的光转换为光电流，再经放大输入指示器，然后显示。经放大输入指示器，然后显示。指示指示器：显示器：显示A或或T 。1、光源、光源要求：要求：波长范围宽，连续光谱，强度足够，稳定波长范围宽，连续光谱，强度足够，稳定可见光谱：可见光谱： 钨灯钨灯 (612V) 3202500nm 碘钨灯碘钨灯(612V) 发光强度高寿命长发光强度高寿命长紫外光谱：紫外光谱： 氢灯氢灯 180375nm 氘灯氘灯 发光强度发光强度 使用寿命比氢灯增加

14、使用寿命比氢灯增加23倍倍 都需要电压稳定的电源供电。都需要电压稳定的电源供电。2、单色器、单色器棱镜单色器：棱镜单色器： 单色光纯度由棱镜的色散率和出射狭缝宽度决定单色光纯度由棱镜的色散率和出射狭缝宽度决定玻璃棱镜用于玻璃棱镜用于3503200nm波长，可见分光光度计波长，可见分光光度计石英棱镜用于石英棱镜用于1854000nm波长，紫外波长，紫外-可见分光光度计可见分光光度计光栅单色器：光栅单色器： 利用光的衍射和干射作用制成的元件利用光的衍射和干射作用制成的元件优点：适用波长范围宽，色散均匀，分率高优点：适用波长范围宽，色散均匀，分率高缺点：有重叠和相互干扰缺点：有重叠和相互干扰3、吸收

15、池、吸收池比色皿比色皿玻璃比色皿玻璃比色皿 用于可见光用于可见光石英比色皿用于石英比色皿用于400nm的紫外光的紫外光比色皿的质量要求：无色、透明、耐腐蚀、同一比色皿的质量要求：无色、透明、耐腐蚀、同一厚度的透光率误差厚度的透光率误差 Cs）适宜适宜 高高 浓度的测定浓度的测定ACCxAx差示工作曲线差示工作曲线方法：方法：标准溶液标准溶液Cs 、 C1、C2、C3。以以Cs作参比，调作参比，调A = 0. 测测C1 、C2、C3的的A。4.示差法示差法作作AC差示工作曲线差示工作曲线.同条件下测同条件下测Ax.从中查出从中查出Cx.第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法n一、分光光度法的误差一

16、、分光光度法的误差n1、仪器测定误差、仪器测定误差 n光电管灵敏性差、光源光电管灵敏性差、光源不稳定及读数不准。不稳定及读数不准。n透光率误差透光率误差 T引起浓度引起浓度误差误差 c：n透光率透光率20% 65%，A为为0.20.7时，浓度相对误时，浓度相对误差较小。差较小。 测量误差和透光率的关系 TTTcclg0.434n2、溶液偏离、溶液偏离Beer定律定律 偏离偏离Beer定律，定律，A-c曲线曲线弯曲。主要原因：弯曲。主要原因：化学因素化学因素 吸光物质吸光物质发生解离、缔合、溶发生解离、缔合、溶剂化等现象；剂化等现象；光学因素光学因素 复色光引复色光引起对起对Beer定律的偏离。

17、定律的偏离。主观误差主观误差两种不同吸光系数的混合光对Beer定律的偏离 1、选择适当的显色剂、选择适当的显色剂灵敏度高灵敏度高 选择性好选择性好显色剂在测定波长处无明显吸收显色剂在测定波长处无明显吸收反应生成的有色化合物组成恒定。反应生成的有色化合物组成恒定。二、提高测量灵敏度和准确度的方法二、提高测量灵敏度和准确度的方法2. 选择合适的测定条件选择合适的测定条件 (1)入射光波长的选择入射光波长的选择 一般选择一般选择max作为入射光的波长，但有干扰存在作为入射光的波长，但有干扰存在时，应兼顾灵敏度和选择性来选择入射光的波长。时，应兼顾灵敏度和选择性来选择入射光的波长。 根据朗伯根据朗伯-

18、比耳定律比耳定律 ，两边微分得，两边微分得: ，或，或 abcTlgTTdTcdclg434. 0TTTcclg434. 0 对于一定的光度计，对于一定的光度计，T是是一个常数，故以一个常数，故以c/c对对T（或（或A）作图）作图 ,可知：可知：a.透光度在透光度在10% 70%，或吸，或吸光度在光度在1.0 0.15，浓度的相，浓度的相对误差较小对误差较小 ;b.透光度在透光度在36.8%或吸光度在或吸光度在0.434时，测定的相对误差最时，测定的相对误差最小。小。 (2)光度计读数范围的选择光度计读数范围的选择 3. 空白溶液的选择空白溶液的选择 n参比液选用原则：使测量的A真正反映待测物

19、浓度4、共存离子的干扰及其消除、共存离子的干扰及其消除控制显色反应的酸度控制显色反应的酸度 加入掩蔽剂加入掩蔽剂 分离干扰离子分离干扰离子n16.5 紫外分光光度法的应用紫外分光光度法的应用n一、定性鉴别一、定性鉴别比较比较 max、 ( max)或或a( max) 比较吸光度比较吸光度(或吸光系数的比值或吸光系数的比值) 二、定量测定二、定量测定 如杂质检查如杂质检查 如果化合物在紫外如果化合物在紫外-可见光区没有明显吸收，而所含杂可见光区没有明显吸收，而所含杂质有较强的吸收，那么含有少量杂质就可用光谱检查出来。质有较强的吸收，那么含有少量杂质就可用光谱检查出来。例如，乙醇和环己烷中若含少量杂质苯，苯在例如，乙醇和环己烷中若含少量杂质苯，苯在256 nm处处有吸收峰，而乙醇和环己烷在此波长处无吸收，乙醇中含有吸收峰，而乙醇和环己烷在此波长处无吸收，乙醇中含苯量低达苯量低达0.001%也能从光谱中检查出来。也能从光谱中检查出来。三、有机化合物的结构分析三、有机化合物的结构分析1.从吸收光谱中初步推断基团从吸收光谱中初步推断基团2.异构体的推定异构体的推定 许多结构异构体可利用其双键的位置不同，应用许多结构异构体可利用其双