植物组织培养设备及条件

1、第二章第二章 实验室实验室设计设计和和培养培养条件条件第一节第一节 实验室设计及基本技术实验室设计及基本技术第二节第二节 植物组织培养所要求的环境条件植物组织培养所要求的环境条件第一节第一节 实验室设计及实验室设计及基本技术基本技术一、实验室组成一、实验室组成二、仪器设备二、仪器设备三、培养器皿三、培养器皿及实验用具及实验用具四、洗涤技术四、洗涤技术五、灭菌技术五、灭菌技术六、无菌操作六、无菌操作 组织培养实验室布局的总体要求组织培养实验室布局的总体要求 便于隔离便于隔离 便于操作便于操作 便于灭菌便于灭菌 便于观察便于观察一一、实验室组成基本实验室基本实验室辅助实验室辅助实验室实验室实验室组

2、成组成准备室准备室缓冲室缓冲室无菌操作室无菌操作室培养室培养室细胞生物学实验室细胞生物学实验室温温 室室生化分析实验室生化分析实验室水槽水槽实实验验台台搁搁架架培养架培养架培养架培养架培培养养架架培培养养架架药药品品及及仪仪器器柜柜无菌台无菌台无菌台无菌台搁搁架架拉拉窗窗冰箱冰箱搁搁 架架电电炉炉门门4.5m3.0m3.5m4.0m准备室准备室缓冲室缓冲室无菌室无菌室培养室培养室组织培养准备实验室组织培养准备实验室准备室准备室缓缓 冲冲 室室无无 菌菌 室室无无 菌菌 室室培培 养养 室室培养架培养架培养间二、仪器设备二、仪器设备1）、基本仪器设备 冰箱、电（磁）炉、酸度计、纯水器、天平、移液

3、器、解剖镜、光照培养箱、摇床、生化培养箱、培养基分装器、搅拌器等。冰箱冰箱酸度计酸度计电炉电炉天平天平纯水纯水器培养基分装器培养基分装器搅拌器搅拌器摇 床体式显微镜体式显微镜倒置显微镜倒置显微镜冷光源冷光源 电磁搅拌器电磁搅拌器摇床摇床 2）、）、灭菌设备灭菌设备 蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。蒸汽压力灭菌锅蒸汽压力灭菌锅高压灭菌器干热消毒柜干热消毒柜75%酒精喷雾器酒精喷雾器喷雾消毒器喷雾消毒器3）、）、无菌操作设备无菌操作设备 超净工作台超净工作台二、设备、仪器二、设备、仪器超净工作台超净工作台

4、（一）设备（一）设备1.紫外线灭菌灯紫外线灭菌灯 2.日光灯日光灯 3.工作台工作台 4.凳子凳子 5.搁物架搁物架 6.窗窗 7.推拉门推拉门 8.缓冲间缓冲间无菌接种箱无菌接种箱4、细胞培养设备、细胞培养设备 摇 床培养架培养架HZC-250恒温振荡培养箱恒温振荡培养箱 150C 250D 光照培养箱光照培养箱 光照培养箱光照培养箱烘箱烘箱5、细胞学鉴定设备、细胞学鉴定设备 光学显微镜、体视光学显微镜、体视显微镜、倒置显微镜显微镜、倒置显微镜倒置显微镜倒置显微镜光学显微镜光学显微镜电子天平电子天平（0.0001g， 0.001g） 酸度计酸度计1、玻璃器皿、玻璃器皿三、培养器皿及实验用具三

5、、培养器皿及实验用具培养皿培养皿三角瓶三角瓶培养瓶培养瓶2、金属材质用具、金属材质用具镊子镊子 解剖刀解剖刀接种针接种针（二）各类器皿（二）各类器皿 1 1器皿的类型器皿的类型（1 1）培养器皿）培养器皿三角瓶三角瓶、培养瓶、圆形培养瓶、培养瓶、圆形培养瓶、试管试管、L L形管和形管和T T形管形管 （2 2）分注器）分注器 （3 3）刻度移液管）刻度移液管（4 4）微量移液器微量移液器（5）细菌过滤器细菌过滤器（三）器械用具（三）器械用具 打孔器打孔器 镊子镊子 解剖刀解剖刀 接种针接种针 剪刀剪刀 电热灭菌器电热灭菌器 四、洗涤技术四、洗涤技术1、玻璃器皿洗涤、玻璃器皿洗涤已用过的玻已用过

6、的玻璃璃器皿器皿浸渍浸渍12h洗衣粉洗洗衣粉洗涤涤清水清水冲洗冲洗晾干晾干备用备用新购置玻璃新购置玻璃器皿器皿2、塑料用品洗涤、塑料用品洗涤新的塑料器皿打开即用新的塑料器皿打开即用已用过的塑已用过的塑料器皿料器皿2%NaOH浸泡浸泡12h清水冲清水冲洗洗2%5%盐酸盐酸浸泡浸泡30min清水清水冲洗冲洗蒸馏水冲蒸馏水冲洗洗晾干备用晾干备用3、金属用品洗涤、金属用品洗涤热洗衣粉水热洗衣粉水洗净洗净冲洗冲洗擦干擦干五、灭菌技术五、灭菌技术物理方法物理方法：干干热、湿热、射线处理、过滤除菌等热、湿热、射线处理、过滤除菌等化学方法化学方法： 消毒剂、抗菌素灭菌消毒剂、抗菌素灭菌1、灭菌方法、灭菌方法2

7、、灭菌、灭菌（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法 压力在0.1M0.2MPa 温度在121 灭菌1030min（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌 干热消毒灭菌饱和蒸汽压力与其对应的温度饱和蒸汽压力与其对应的温度饱和蒸汽压力饱和蒸汽压力温度（温度（）饱和蒸汽压力饱和蒸汽压力温度（温度（）kg/cm21b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0551.1251.2661.4061.5431.68115161820222430501

8、21.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.6（3）塑料器皿灭菌：塑料器皿灭菌： 多采用多采用高压蒸汽消毒灭菌高压蒸汽消毒灭菌（4）金属用具灭菌：）金属用具灭菌：灼烧灭菌灼烧灭菌 浸入浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用却后使用（5）接种室灭菌）接种室灭菌空气消空气消毒灭菌毒灭菌接种室接种室超净工超净工作台作台紫外灯紫外灯照射照射70%75%的酒精擦洗的酒精擦洗培养材料培养材料的接种的接种紫外灯紫外灯照射照射（6）外植体灭菌）外植体灭菌流水冲洗流水冲洗1020min或更长时间或更长时间70%75%酒精中浸泡酒精中浸泡30

9、s0.1%0.2%氯化汞氯化汞液中浸泡液中浸泡10min左右左右蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗45次次在在10%的的次氯酸钠次氯酸钠、饱和饱和漂白粉漂白粉浸泡浸泡30min左右左右备用备用常用消毒剂消毒灭菌比较表常用消毒剂消毒灭菌比较表消毒剂消毒剂使用浓度使用浓度（%）去除难易去除难易消毒时间消毒时间（min）效果效果次氯酸钙次氯酸钙次氯酸钠次氯酸钠漂白粉漂白粉溴水溴水过氧化氢过氧化氢升汞升汞酒精酒精抗生素抗生素硝酸银硝酸银9102饱和溶液饱和溶液1210120.11707545（mg/L1易易易易易易易易最易最易较难较难易易中中较难较难5305305302105152100.223060530很好很好

10、很好很好很好很好很好很好好好最好最好好好较好较好好好 消毒消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接，更换实验服、帽子与鞋子，进入接种室。种室。 打开打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射照射40min左右，后关闭。左右，后关闭。 开启过滤风机开启过滤风机，使无菌风吹拂工作台面和，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。四周的台壁。 用用70%75%的酒精擦拭工作台和双手的酒精擦拭工作台和双手。（7）接种准备）接种准备六、无菌操作六、无菌操作实验员消毒实验员消毒实验室、无实验室、无菌台灭菌菌台灭菌实验器材实验器材的灭菌的灭菌无菌接种无菌接种消消 毒毒实验台实验台卫生卫生培

11、养室培养室培养培养 植物组织培养是在严格植物组织培养是在严格无菌的条件下无菌的条件下进行的，要做到无菌的条进行的，要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、人工控制温度、光照、湿度光照、湿度等培养条件。等培养条件。 准备室准备室：器具的洗涤、干燥、保存、灭菌，各种药品的储备、：器具的洗涤、干燥、保存、灭菌，各种药品的储备、称量、溶解、配制、培养基分装等，称量、溶解、配制、培养基分装等，设备：设备：药品柜、防尘厨、冰药品柜、防尘厨、冰箱、天平、纯水仪、酸度计、操作台、灭菌锅、烘箱。箱、天平、纯水仪、酸度计、操作台、灭菌锅、烘箱

12、。 实验室设计原则：实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。化学室化学室/准备室、接种室、培养室。准备室、接种室、培养室。小小 结结 接种室：接种室：植物材料的消毒、接种、培养物转移、试管苗继代、植物材料的消毒、接种、培养物转移、试管苗继代、原生质体制备及其它需要进行的无菌操作。原生质体制备及其它需要进行的无菌操作。设备：设备：紫外光源、超紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（镊子、剪刀、解剖刀、净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（镊子、剪刀、解剖刀、接种针）。清洁和消毒，减少与外界空气对流，接种针）。清洁和消毒，减少与外界空气对流

13、，穿实验服及换鞋穿实验服及换鞋以减少带入杂菌。以减少带入杂菌。 培养室：培养室：墙壁要求墙壁要求绝热防火的性能绝热防火的性能，培养架由金属制成，底，培养架由金属制成，底层离地高约层离地高约10cm，层间隔层间隔40cm，总高总高1.7m左右，长度根据日光灯左右，长度根据日光灯的长度而设计，的长度而设计，宽度为宽度为60cm。第二节第二节 植物组织培养所需的环境植物组织培养所需的环境 条件及营养成分条件及营养成分一、环境条件一、环境条件 与自然条件一样，组织培养中的外植体的生长要受到与自然条件一样，组织培养中的外植体的生长要受到温度、光照、湿度温度、光照、湿度等各种物理条件，等各种物理条件，不同

14、不同培养基培养基组组成、成、pH值、渗透压值、渗透压等各种化学条件，以及等各种化学条件，以及外植体部位、大小、细胞外植体部位、大小、细胞密度密度等各种生物条件等环境条件的影响。如何根据需要来控等各种生物条件等环境条件的影响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一个重要问题。制培养条件是组织培养中的一个重要问题。温度温度光照光照湿度湿度气体气体渗透压渗透压pH值值一般最适温度在一般最适温度在252之间之间环境条件环境条件最常用的是最常用的是光照光照16h，黑暗，黑暗8h 一般情况下，培养器内相对湿度应达一般情况下，培养器内相对湿度应达100%，培养，培养室内环境的相对湿度在室内环境的相对湿度

15、在70%80% 氧气氧气是愈伤组织生长所必需是愈伤组织生长所必需的的调节渗透压常常从调节渗透压常常从糖糖入手入手 培养基的培养基的pH值大多在值大多在5.06.5，5.8温度在温度在20-27左右，空调控温，湿度恒定，相对湿度左右，空调控温，湿度恒定，相对湿度在在70-80%，光照由定时开关控制，每天，光照由定时开关控制，每天光照光照10-16h左右，左右，不同植物决定光照时间，培养室可采用太阳光为能源，不同植物决定光照时间，培养室可采用太阳光为能源，易成活，阴雨天用室内灯光补光。易成活，阴雨天用室内灯光补光。二、营养成分二、营养成分 植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植植物体内

16、至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：物体内起到一定的生理作用：a a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质结构物质；b b、构成一些特殊的、构成一些特殊的生理活性物质生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；，参与活跃的新陈代谢；c c、元素之间相互协调，以维持、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡离子浓度平衡、胶体稳、胶体稳 定、电荷平衡点等化学方面的作用；定、电荷平衡点等化学方面的作用；d d、发育方面发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、，特定的元素影响植物的形态发生和组织、 器官建成。器官建成。Arnon和和

17、Stout（1939）提出的确定植物必需营养元素的）提出的确定植物必需营养元素的3个个标准标准:A、缺乏该元素，、缺乏该元素，植物生育发生障碍植物生育发生障碍，不能完成其生活史，不能完成其生活史;B、缺乏该元素，就表现为专一的、缺乏该元素，就表现为专一的病症病症，且这种缺素症可以用补充，且这种缺素症可以用补充该元素来预防和恢复该元素来预防和恢复;C、该元素在、该元素在植物营养生理上表现直接的效果植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件物理、化学、微生物条件的变化而的变化而产生的间接效果。产生的间接效果。 国内外公认的高等植物所必需的营养元素有国内外

18、公认的高等植物所必需的营养元素有16（17）种：）种： C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（、（Ni） 在植物中在植物中含量含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。件下含量也不同。根据植物体内含量多少，可把这些元素分为根据植物体内含量多少，可把这些元素分为大量营养元素大量营养元素：占干物质重量的：占干物质重量的0.1%以上以上；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等等9种种微量营养元素微量营养元素：占干物质重量的：占干物质重量的0.1%以下，有以下，有的只含的只含0.1mg/kg， Fe

19、、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等等7种种按照国际植物生理协会的建议：按照国际植物生理协会的建议： 所需浓度所需浓度 0.5mmol/L 0.5mmol/L的元素为大量元素的元素为大量元素 所需浓度所需浓度 0.5mmol/L 0.5mmol/L的元素为微量元素的元素为微量元素1、大量元素、大量元素N N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。 P P是磷脂的主要成分。培养基中常用是磷脂的主要成分。培养基中常用KHKH2 2POPO4 4 、Na

20、HNaH2 2POPO4 4等。等。 K K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。MgMg、S S、CaCa是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；白体结构具有稳定作用；S S是含是含S S氨基酸的蛋白质的组成成分。氨基酸的蛋白质的组成成分。CaCa是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，用，此外，CaCa及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。2、微量元素、

21、微量元素 在微量元素中，在微量元素中，铁铁的使用最大：的使用最大： 一些氧化酶的组成成分一些氧化酶的组成成分 叶绿素形成的必要条件叶绿素形成的必要条件 使用乙二胺四乙酸铁（使用乙二胺四乙酸铁（EDTA-FeEDTA-Fe）鳌合物防止铁的沉淀）鳌合物防止铁的沉淀 硼硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系 铜铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长长 锰锰参与植物的光合、呼吸代谢参与植物的光合、呼吸代谢 钼钼参与氮素的代谢参与氮素的代谢 氯氯是光合作用水光解的活化剂是光合作用水光解的活化剂 微量元素的主要作用是作为微量元素

22、的主要作用是作为酶的辅助因子或激酶的辅助因子或激活剂活剂参与代谢的调节参与代谢的调节。 组织培养的条件组织培养的条件营养条件营养条件（培养基），组织培养的重要基质，不同植物的组织（培养基），组织培养的重要基质，不同植物的组织对营养有不同的要求，合适培养基才能成功。对营养有不同的要求，合适培养基才能成功。MS培养基培养基：1962年由年由Murashige和和Skoog为培养烟草细胞设计，为培养烟草细胞设计，无机盐浓度较高，硝酸盐含量高，用于无机盐浓度较高，硝酸盐含量高，用于植物器官、花药、细胞植物器官、花药、细胞的组培，有些培养基是由它演变而来。的组培，有些培养基是由它演变而来。B5培养基培养

23、基：1968年由年由Galmborg为培养大豆为培养大豆根细胞根细胞设计，含有设计，含有较低的铵盐，适合双子叶植物、木本植物较低的铵盐，适合双子叶植物、木本植物White培养基培养基：1943年由年由White为培养番茄为培养番茄根尖根尖设计，设计，MgSO4、硼盐浓度高，无机盐浓度低，适于生根培养。硼盐浓度高，无机盐浓度低，适于生根培养。N6培养基培养基：1974年由朱至清为禾谷类年由朱至清为禾谷类花药培养花药培养而设计，而设计，KNO3和（和（NH4）2SO4浓度高，适于花药培养。浓度高，适于花药培养。KM-8P培养基培养基：1974年为年为原生质体培养原生质体培养而设计，有机成分复杂，而

24、设计，有机成分复杂，包括了所有的单糖及维生素，适于原生质体融合培养。包括了所有的单糖及维生素，适于原生质体融合培养。培养基培养基成分主要是成分主要是水、无机盐、有机物、天然复合物、培养基中的水、无机盐、有机物、天然复合物、培养基中的凝胶凝胶无机盐无机盐：大量元素（大于：大量元素（大于0.5mmol/L的元素）、微量元素。的元素）、微量元素。N：是蛋白、维生素、核酸、磷脂等的组成成分，培养基中有是蛋白、维生素、核酸、磷脂等的组成成分，培养基中有NO3-、NH4+供应形式，如供应形式，如KNO3、NH4NO3、（、（NH4）2SO4等。等。P：磷脂、：磷脂、ATP等的组成成分，常用的有等的组成成分

25、，常用的有KH2PO4、NaH2PO4等等K：与糖类合成、蛋白代谢有关，常以：与糖类合成、蛋白代谢有关，常以KCL、KNO3在培养基中提供在培养基中提供Mg、S、Ca：是叶绿素、酶、细胞壁的组成成分，：是叶绿素、酶、细胞壁的组成成分，MgSO47H2O、CaCL2 7H2O微量元素：微量元素：小于小于0.5mmol/L，Fe、Zn、B、Mn、Cu、Mo、Co等；等；FeSO47H2O与与Na2-EDTA配成配成铁盐溶液铁盐溶液。碳水化合物：碳水化合物：常用的是蔗糖、葡萄糖，常用浓度为常用的是蔗糖、葡萄糖，常用浓度为3%。维生素：维生素：以辅酶的形式参与多种代谢，对生长、分化有促进作用，以辅酶的

26、形式参与多种代谢，对生长、分化有促进作用，VB1（盐酸硫胺素）、（盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、（盐酸吡哆醇）、VB12、VPP（烟酸）、（烟酸）、VC（抗坏（抗坏血酸）、生物素、叶酸。血酸）、生物素、叶酸。肌醇：肌醇：环己六醇，参与细胞壁、细胞膜构建，环己六醇，参与细胞壁、细胞膜构建，100mg/L氨基酸氨基酸-有机氮源，细胞直接吸收，甘氨酸、天冬氨酸、谷酰胺、水有机氮源，细胞直接吸收，甘氨酸、天冬氨酸、谷酰胺、水解乳蛋白（氨基酸混合物）等，解乳蛋白（氨基酸混合物）等，10-1000mg/L天然复合物天然复合物-椰子乳、香蕉、马铃薯滤液、酵母提取液、麦芽提取液、椰子乳、香蕉、马铃薯滤液

27、、酵母提取液、麦芽提取液、番茄汁等，不易培养时使用。番茄汁等，不易培养时使用。植物激素植物激素-培养基的关键物质，生长素类（培养基的关键物质，生长素类（IAA、NAA、IBA、2,4-D；细胞分裂素（细胞分裂素（6-BA、KT、ZT）；赤霉素（）；赤霉素（GA3）生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素：高：高利于根、愈伤组织形成；适中利于根、愈伤组织形成；适中利于根、芽利于根、芽分化；低分化；低利于芽的形成利于芽的形成培养基的支持物培养基的支持物琼脂（固体培养时的固化剂，低于琼脂（固体培养时的固化剂，低于40度为凝度为凝胶，胶，6-10g/L），玻璃纤维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，），玻璃纤

28、维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是降低培养材料产生的有害物影响总的要求是降低培养材料产生的有害物影响抗生素抗生素-卡那霉素、头孢、青霉素、链霉素、庆大霉素等，卡那霉素、头孢、青霉素、链霉素、庆大霉素等，5-20mg/L，防止菌类污染。，防止菌类污染。活性炭活性炭-吸附培养基中的杂质、酚、醌类、灭菌副产物等，吸附培养基中的杂质、酚、醌类、灭菌副产物等，0.5-10g/L 缺铁症状缺铁症状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。 桃树桃树缺铜症状：缺铜症状： 新梢顶端叶片的叶尖失绿新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色变黄，叶片出现褐色斑点，斑点，扩