基因工程笔记

1、 1 .什么叫基因工程（Gene Engineering），试从理论和技术两个方面谈谈Gene Engineering诞生的基础？基因工程：在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原来没有这类分子的宿主细胞内，而能持续稳定地繁殖。理论基础： 1944年，美国生物学家Avery等通过细菌转化研究，证明DNA是基因载体，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题；1953年Watson和Crick建立了DNA分子的双螺旋结构模型， 1958年至1972年揭示了先后确立了中心法则，破译了64种密码子技术基础：20世纪60年代末70年代初

2、，限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现使DNA分子进行体外的切割和连接成为可能；1972年首次构建了一个重组DNA分子，提出了体外重组的DNA分子如何进入宿主细胞，并在其中进行复制和有效表达等问题。经研究发现，质粒分子是承载外源DNA片段的理想载体，病毒，噬菌体的DNA(或RNA)也可改造成载体1973年大肠杆菌转化体系的建立，这实验结果说明基因工程问世，不仅宣告质粒分子可作为基因克隆载体，能携带外源DNA导入宿主细胞，并且证实真核生物基因可转移到原核生物细胞中，并在其中实现功能的表达（基因工程诞生的元年）克隆：作为名词使用时，是指某一个体（或细胞、分子等）通过无性繁殖的方式产生的具有相同遗传

3、背景的后代（或子细胞、分子等）组成的集体（或群体）；作为动词使用时，指产生上述集体或群体的过程。质粒小量提取中,溶液、作用是什么?溶液是使细胞完全分散溶液是使细胞壁破裂，DNA变性溶液是使质粒选择性复性，而染色体DNA随同SDS和蛋白质一起沉淀下来限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（48bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)限制片段长度多态性：指用某一种限制性内切酶来切割来自不同个体的基因组DNA或某一个基因，会

4、得到不同长度的DNA片段。可用于基因组图谱构建、致病基因检测、基因定位、生物进化和分类的研究等v限制性图谱（restriction map):是指一系列限制酶的特异识别序列在DNA链上的出现频率和它们之间的相对位置。又称物理图谱（physical map)核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性I类内切酶II类内切酶III类内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ ATP、 Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：A

5、AC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG切割位点在距离识别位点至少1000 bp处随机切开一条单链。位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3端2426bp处酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用常用的DNA聚合酶的特点共同特点：把dNTPs连续地加到引物的3OH端。主要区别：持续合成能力和外切酶活性不同。2 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶

6、只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。3. 常用DNA聚合酶的特性比较DNA聚合酶35外切酶活性53外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenow fragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中Taq DNA聚合酶无有快高Taq聚合酶：TaqDN聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。最适温度高75-80 oC功能缺点，具有53聚合酶活性和53外切酶活性，但没有35外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对！Taq DNA聚合

7、酶的激活剂金属离子敏感（尤其是Mg2+末端脱氧核苷酸转移酶（terminal transferase）：特性：（1） 53DNA聚合酶活性需要3OH、二甲胂酸缓冲液。不需要模板！底物可以是单链DNA、是3OH突出的双链DNA、平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。随机添加的dNTPs。如果只有一种dNTP，就添加上同聚物末端转移酶的用途（1）同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。（2）再生酶切位点，便于回收克隆片断。（3）非放射性标记DNA片断的3端催化非放射性标记物参入DNA片断的3端。（生物素-11-dUTP等）S1核酸酶：特性（1）高度单链特异

8、性（2）反应条件：低水平Zn2+ ， pH4.04.3、S1核酸内切酶的功能（1）催化单链RNA或DNA降解。（2）切掉双链核酸中的单链区。发卡或有缺口的部位。3）降解限制酶切形成的单链突出端。（4）不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链. S1核酸酶的用途（1）定位RNA 内切酶位点不能位于内含子序列中！（2）用mRNA测定基因中的外显子序列不能配对的内含子区域形成的单链环被S1切掉。 pBR322：F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。（1）元件来源复制起点ori pMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点Ampr基因 pSP2124质粒的Ampr基因T

9、etr基因 pSC101的Tetr基因。（2）长度（3）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点24个克隆位点。其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）3个会导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。见图P93 （5）pBR322的优点 双抗菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因BamH I ：Amp中存活，但在Tet中死亡外源基因Pst I：Tet中存活，但在Amp中死亡分子小，克隆能力大载体越小越好。 10kb的DNA在纯化过

10、程中容易断裂。 高拷贝数氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy 安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。（6）pBR322的缺点保留了转移蛋白（mob）的作用位点。能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！（7）PBR322的改进删除mob识别位点（如质粒pBR327、pAT153等）。pAT153：从pBR322上切去HaeII片断，既除去了mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。改造EcoR I 位点 pBR325：使EcoRI也成为插入失活型位点。在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切

11、片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。cmlr上也带一个EcoRI位点。pUC系列University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19（3）元件来源复制起点：pBR322的oriAmpr基因pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位点。lacZ的启动子：大肠杆菌lacZ基因：大肠杆菌lacZ的a-肽链序列，是LacZ的氨基端片断。（2）长度约2.7kb（3）克隆位点 10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ基因的5端T

12、i质粒: 存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）天然Ti质粒作载体的缺点（1）分子量太大（200kb）！（2）限制性酶切位点太多。（3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能再分化。（4）在大肠杆菌中不能复制。. Ti质粒的改造（1）保留T-DNA的转移功能部分（vir基因，左右边界）。（2）减少限制性酶切位点，引入单一插入位点。（3）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植物细胞不再成为肿瘤，能正常分化。（4）冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。（5）加入大肠杆菌的ori和选择标记。（6）加上真核生物的转录信号和结束信

13、号以及添加polyA的信号序列。改造后的Ti质粒载体模式双元质粒载体和共整合载体应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）：在体外特异性地扩增某个基因。可用于目的基因的扩增和分离Primer设计的一般原则：1 位置：与待扩增的模板DNA区段的两3端序列互补（ 5端相同）的短DNA2 引物长度至少16bp,一般引物设计为长1530bp3 引物的碱基序列 3端必须与模板正确配对，5端可以不配对4 引物的碱基组成1）尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力2）避免连续相同碱基排列或内部回文序列. 5 避免形成引物二聚体（dimer）两个引物之间不能有两个以

14、上的连续碱基序列互补6 当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55 oC。实际复性温度选择低于Tm值5 oC。适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现7 引物的浓度一般使用终浓度各0.5mmol/L8 简并引物如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。 需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物9 套嵌引物（nested primers)设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。PCR技术的原理模板DNA变性引物DNA复性引物DNA延伸1）DNA模板变性9

15、5oC双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。（2）DNA模板与引物复性40-65oC引物（primer）: 人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5端相同。（3）DNA链的延伸72oC DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。PCR的过程（1）第一步变性（denature）94-95 oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。（2）第二步复性（anneal）50-60 oC下1分钟，引物优先与模板复性。引物的浓度高，引物的链短。（3）第三步延伸（extend）72oC下1-2分钟，Taq DNA聚合酶在引物的3端上加上核苷酸。

16、（4）第四步变性（denature）94oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。（5）第五步重复（repeat）温度循环95oC 5min94oC 1min72oC 2min50oC 1min PCR的特点（1）特异性强PCR使用专门合成的DNA引物。延伸过程是在高温下进行。这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。（2）敏感性高需要的模板量极低。理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！（3）快速整个PCR过程约4小时即可完成。（4）简便对模板的纯度要求低，不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。（5）

17、可以扩增mRNA先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。目的基因的制备：目的基因：即供体，准备要分离、改造、扩增或表达的基因。主要是编码蛋白质（酶）的结构基因 。是能满足人们特殊需要有价值的基因目的基因的制备方法：（已知目的基因序列：直接分离法，PCR法，化学合成法;未知目的基因序列：构建基因(DNA）文库分离法，差别杂交法和差示分析法） 直接分离法:限制性内切酶法随机片断化(1. 限制性内切酶局部消化法2. 机械切割法)化学合成法:磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。PCR扩增获得目的基因1. 直接从基因组中扩增（1）提取基因组DNA作模板（

18、2）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增适合扩增原核生物基因。真核生物基因组含有内含子！2. 从mRNA中扩增: RT-PCR（1）提取基因组 total RNA（2）反转录合成总cDNA作模板（3）根据目的基因序列设计引物（4）PCR扩增适合扩增真核生物基因。原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。.什么是Gene library？它与cDNA library有何区别？ 由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体, 称之为基因文库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经

19、反转录形成的cDNA，它们所构成的重组DNA克隆群体，则称之为cDNA基因文库区别：基因组文库克隆的是任何，包括未知功能的DNA序列、调控基因，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因。基因组文库克隆的的全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，因它受发育的调控因子的影响。基因组文库中的编码基因是真实的基因，含有内含子和外显子；而cDNA克隆的是不含内含子的基因 基因组文库：构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。（1）对载体的要求载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（2）目前

20、常用的载体l载体系列：容量为 24 kpcosmid载体：容量为 50 kb YAC：容量为 1 Mb BAC: 容量为 300 kbYAC载体基因组文库的大小一个完整的基因组文库所需的克隆总数应取决于外源基因组的大小以及切割片段的大小估算方法：基因组文库的克隆数目=基因组DNA总长/DNA插入片段的平均长例：某生物基因组总长3*106kb，酶切切后片段平均长15kb，理论上，基因组文库含的克隆数为3*106/15=2*105一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N：所

21、需的重组载体数（克隆数）基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性（基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率）外，一个理想的基因文库应具备下列条件:重组克隆的总数不宜过大以减轻筛选工作的压力克隆载体的装载量最好大于基因的长度避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选噬菌体基因组文库的构建：噬菌体基因组文库的构建步骤：获得含目的基因的DNA片段与噬菌体克隆载体进行重组连接产物在体外进行包装基因组文库扩增或目的基因的筛选一种方法经过分级分离：以EMBL3载体构建文库为例另一种不经分级分离，通过填

22、充基因组DNA，也是一种较优良的方法（P173cDNA library：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。代表特定细胞或组织中mRNA的文库cDNA文库的特点（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。RACE法(rapid amplification of cDNA ends)cDNA末端快速扩增技术，是基于PCR技术由已知的部分cDNA顺序来获得完整cDNA5和3端的方法，也称锚定PCR和单边PCR 书P186是以mRNA为模板，反转录合

23、成cDNA的第一条链，然后用PCR技术扩增出从某个特定位点到3端或到5端之间的未知核苷酸序列cDNA文库的大小：丰度等级相应丰度等级的mRNA群体占总mRNA的百分数（%）在相应丰度等级中所含的不同种类mRNA序列的数目(个）每个细胞所含的相应丰度mRNA序列的拷贝数（个）高丰度22303500中丰度491090230低丰度291067014cDNA基因文的大小可按以下理论公式估算： 基因文库中cDNA的克隆数目=细胞中总mRNA的数目/细胞中某种mRNA的拷贝数 例：获得一个能够代表全部低丰度mRNA的cDNA文库的克隆数为=（30*3500+1090*230+10670*14）/14=35

24、750但实际上所需构建的cDNA文库的实际值远远超过理论值估算cDNA基因文库大小的经验公式：N-cDNA基因文库必须的克隆数P-文库中含目的基因DNA片段的出现概率f-某种mRNA的丰度与总mRNA数的比值例：以上述生物为例，若p-99%则N=ln(1-0.99)/ln(1-14/500500)=16000目前用同聚物加尾法或双衔接物法，每微克cDNA都能产生出1*105-6*105个菌落cDNA文库对真核生物基因的分析是十分有用的只含有编码蛋白质的基因文库，减少了无功能基因cDNA没有内含子，基因可直接在E.Coli中表达对鉴别新基因是十分有用的具有组织和细胞类型特异性一般不用原核生物的m

25、RNA构建cDNA文库原核生物的mRNA是很不稳定的原核生物的基因组文库包括了所有的基因组序列，而且是比较容易构建的cDNA文库优越性：1、 cDNA克隆以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒，2、 cDNA基因文库的筛选比较简单易行，一个完整的cDNA基因文库所含克隆数，要比一个完全的基因组文库所含的克隆数少得多3、 cDNA克隆出现的假阳性概率比较低（阳性克隆含有目的基因的序列）4、 cDNA克隆可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接用于基因工程的操作5、 cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究局限性：1、cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受

26、细胞来源或发育时期的影响2、cDNA基因文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区外大量的调控序列的结构与功能方面的信息3、在cDNA基因文库中，相应于高丰度的mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来容易，反之mRNA差异显示反转录PCR（DD RT-PCR）mRNA differential display RT-PCR：分离鉴定差别表达基因 P223mRNA差别显示法的优点： 放大后，灵敏度高，快速，重复性好，所需材料少 可以同时比较多种细胞类型，展现所有差异 可用回收并经扩增的cDNA直接作探针 缺点： 需大范围的筛选 出现漏检，高频率假

27、阳性 间距小，切割难度大抑制性减法杂交（SSH) P231抑制性减法杂交（suppression subtractive hybridization,SSH)是RDA技术的发展，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交技术结合为一体的技术。用于分离两组基因表达差异较小的基因（2）SSH技术的优点： 特异性强，假阳性率低 高灵敏性，保证低丰度mRNA检出 速度快、效率高不足之处： 对起始材料要求较多，一般需要微克量级的的Mrna 得到的cDNA是限制酶消化的cDNA，不是全长Cdna 所研究材料的差异不能太大，最好是细微差异因此，SSH法成为目前寻找有差别表达的基因的适用方法EST(Expressed Sequence Tags)：基因表达的短cDNA序列ST（sequence tag)：寡核苷酸序列标