血液凝固分析仪的原理及应用

1、血液凝固分析仪的原理及应用任远强 杨胜科 本文作者任远强先生，西安交大开元生物科技发展有限公司工程师 ; 杨胜科先生， 长安大学应用化学系副教授。 关键词 : 血凝 血栓与止血 血液凝固分析仪 概述 血栓与止血是血液重要的功能之一，血栓与止血的形成及调节组成了血液内存在的复杂、功能对立的凝血系统和抗凝系统，他们通过各种凝血因子的调节保持着动态平衡，使得生理状态下血液维持了正常的流体状态，既不溢出于血管之外 (出血)，又不凝固于血管之中(血栓形成)。止血与血栓试验的目的就是通过各种凝血因子的检测从不同的侧面、不同环节了解发病原因、病理过程，进而进行疾病的诊断和治疗。 近几年先进仪器在检验医学的应

2、用，使检测方法进入了新阶段，如利用流式细胞仪检测血小板膜蛋白、血浆内各种抗凝血因子抗体，使用分子生物学技术进行遗传病的诊断，甚至用激光共聚焦显微镜观察不同病理过程血小板中钙离子浓度、钙流及钙波动，进一步研究止血与血栓疾病的病理生理及药物作用机制，这些方法使用的仪器昂贵且试剂不易获得，不适合广泛推广应用，更适合试验室研究。血液凝固分析仪 (以下简称血凝仪)的出现解决了此类难题，它是血栓与止血分析的专用仪器，可检测多种血栓与止血指标，为出血和血栓性疾病诊断、溶栓与抗凝治疗监测及疗效观察提供了有价值的指标，是目前血栓/止血实验室中使用的最基本的设备。 1910年，Kottman发明了世界上最早的血凝

3、仪，通过测定血液凝固时粘度的变化来反映血浆凝固的时间。20世纪60年代，机械法血凝仪得到开发，出现了早期的平面磁珠法。70年代以后，由于机械、电子工业的发展，使各种类型的全自动血凝仪先后问世。 80年代，由于发色底物的出现并应用于血液凝固的检测，使全自动血凝仪除了可以进行一般的筛选试验外，尚可以进行凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统单个因子的检测，使抗凝、纤溶的检测成为可能。90年代，全自动血凝仪免疫通道的开发将各种检测方法融为一体，检测的项目更加全面，为血栓与止血的检测提供了新的手段，进入了分子生物学时代。近年来血凝仪发展和改进的趋势主要体现在如下几个方面: 即检测原理的复杂化、检测速度的增加，试

4、剂分配系统准确性的提高和仪器随机分析功能的增强等。 血凝仪的发展方向与全自动生化分析仪一样，即进一步提高仪器的检测自动化程度。根据自动化程度的高低，血凝仪又分为全自动和半自动仪器。全自动仪器的特点是检测速度快，测定项目多，检测原理较复杂和仪器设计的智能化。使用全自动血凝仪时只要将分离出的血浆样品放置在指定的位置，仪器便可完成加样、预温、检测和报告打印等全过程。多数全自动血凝仪可任意选择不同的项目组合进行检测，样品的检测具有随机性，仪器的数据处理和存储功能也较强。半自动血凝仪需手工加样，检测速度较慢，原理较单一，检测项目少，仪器配备的软件功能也很有限。 二 血凝仪的基本原理 不同类型的血凝仪采用

5、的原理也不同，目前主要采用的检测方法有 : 凝固法、底物显色法、免疫法、乳胶凝集法等。由于在血栓/止血检验中最常用的参数，均可用凝固法测量，故目前半自动血凝仪基本上以凝固法测量为主，在全自动血凝仪中，也一定包括凝固法测量方式。 1. 凝固法(生物物理法) 凝固法是通过检测血浆在凝血激活剂作用下的一系列物理量 (光、电、机械运动等)的变化，再由计算机分析所得数据并将之换算成最终结果，所以也可将其称作生物物理法。 a.电流法 电流法利用纤维蛋白原无导电性而纤维蛋白具有导电性的特点，将待测样品作为电路的一部分，根据凝血过程中电路电流的变化来判断纤维蛋白的形成。但由于电流法的不可靠性及单一性，所以很快

6、被更灵敏、更易扩展的光学法所淘汰。 b. 光学法(比浊法) 光学法血凝仪是根据凝固过程中浊度的变化来测定凝血功能。 根据待验样品在凝固过程中光的变化来确定检测终点的。当向样品中加入凝血激活剂后，随着样品中纤维蛋白凝块的形成过程，样品的光强度逐步增加，仪器把这种光学变化描绘成凝固曲线，当样品完全凝固以后，光的强度不再变化。通常是把凝固的起始点作为 0%，凝固终点作为100%，把50%作为凝固时间。光探测器接收这一光的变化，将其转化为电信号，经过放大再被传送到监测器上进行处理，描出凝固曲线。 光学法凝血测试的优点在于灵敏度高、仪器结构简单、易于自动化 ; 缺点是样品的光学异常、测试杯的光洁度、加样

7、中的气泡等都会成为测量的干扰因素。 c.磁珠法 早期的磁珠法是在检测杯中放入一粒磁珠，与杯外一根铁磁金属杆紧贴呈直线状，标本凝固后，由于纤维蛋白的形成，使磁珠移位而偏离金属杆，仪器据此检测出凝固终点，这类仪器也可称为平面磁珠法。早期平面磁珠法能有效克服光学法中样品本底干扰问题，但存在灵敏度低等缺点。 现代磁珠法出现在 20世纪80年代末，90年代初进入商品化。现代磁珠法被称为双磁路磁珠法。双磁路磁珠法的测试原理如下: 测试杯的两侧有一组驱动线圈，它们产生恒定的交变电磁场，使测试杯内特制的去磁小钢珠保持等幅振荡运动。凝血激活剂加入后，随着纤维蛋白的产生增多，血浆的粘稠度增加，小钢珠的运动振幅逐渐

8、减弱，仪器根据另一组测量线圈感应到小钢珠运动的变化，当运动幅度衰减到50%时确定凝固终点。 2. 底物显色法(生物化学法) 底物显色法是通过测定产色底物的吸光度变化来推测所测物质的含量和活性的，该方法又可称为生物化学法。检测通道由一个卤素灯为检测光源，波长一般为 405nm。探测器与光源呈直线，与比色计相仿。 血凝仪使用产色底物检测血栓与止血指标的原理是 : 通过人工合成与天然凝血因子有相似的一段氨基酸排列顺序、并还有特定作用位点的小肽，并将可水解产色的化学基因与作用位点的氨基酸相连。测定时由于凝血因子具有蛋白水解酶的活性，它不仅能作用于天然蛋白质肽链，也能作用于人工合成的肽链底物，从而释放出

9、产色基因，使溶液呈色。产生颜色的深浅与凝血因子活性成比例关系，故可进行精确的定量。目前人工合成的多肽底物有几十种，而最常用的是对硝基苯胺(PNA)，呈黄色，可用405mm波长进行测定。 3. 免疫学方法 在免疫学方法中以纯化的被检物质为抗原，制备相应的抗体，然后用抗原抗体反应对被检物进行定性和定量测定。常用方法有 : a.免疫扩散法。将被检物与相应抗体在一定介质中结合，测定其沉淀环大小，与标准进行比较，计算待测物浓度。此法操作简单，不需特殊设备，但耗时过长，灵敏度不高，仅适于含量较高凝血因子检测。 b.箭电泳。在一定电场中，凝胶支持物内的被检物与其相应抗体结合形成的一个个“火箭峰”，火箭峰的高

10、度与其含量成正比，通过测定峰高并与标准比较进行定量测定。此法操作复杂，临床应用较少。 c.双向免疫电泳。 通过水平与垂直两个方向进行电泳可将某些分子结构异常的凝血因子进行分离。 d.酶联免疫吸附试验(ELISA法)。用酶标抗原或抗体和被检物进行抗原结合反应，经过洗涤除去未结合的抗原或抗体及标本中的干扰物质，留下固定在管壁的抗原抗体复合物，然后加入酶的底物和色原性物质，反应产生有色物质，用酶标仪进行测定，颜色深浅与被检物浓度呈比例关系。该法灵敏度高，特异强，目前已用于许多止血、血栓成分检测。 e.免疫比浊法。 将被检物与其相应抗体混合形成复合物，从而产生足够大的沉淀颗粒，通过透射比浊或散射比浊进

11、行测定。此法操作简便，准确性好，便于自动化。 三 血栓与止血的基本检测指标及可采用的原理 血栓与止血的基本检测指标为 : 凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、凝血酶时间(TT)、内源凝血因子、外源凝血因子、高分子量肝素、低分子量肝素、蛋白C、蛋白S等，血凝仪检测各项指标时采用了不同的原理，表1列出了目前可开展的血栓/止血成份检测方法。 四 国内常见的几种型号血凝仪的性能比较 1. 国内应用情况 目前国内使用的血凝仪主要为进口仪器。早期引进的血凝仪多是价格偏低、检测速度慢、测定项目较少的半自动仪器，且数量较少。随着国内经济发展水平的提高，近 5年来引进的仪器数量大大增加，主要以全