脂肪源干细胞修复兔膝关节全层软骨缺损研究

1、脂肪源干细胞修复兔膝关节全层软骨缺损研究         10-05-05 16:54:00     作者：李磊    编辑：studa20【摘要】  观察评价兔膝关节髌股关节面中心人工制造全层关节软骨缺损后，单纯脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶移植到软骨缺损处对关节全层软骨缺损的修复效果，以探索关节软骨缺损修复简单有效的途径。方法新西兰大白兔27只随机分为A、B、C三组，A组关节软骨缺损处置入海藻酸钙凝胶，B组软骨缺损处不做任何

2、处理，C组缺损处置入未经诱导的脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶，分别于术后第4、8、12周处死动物，通过大体、组织切片观察以及透射电镜等技术手段对修复效果进行观测，采用改良的Wakitani评分标准对修复组织进行评分，所得评分采用统计软件SPSS 11.5进行统计学分析。结果A、B组软骨缺损处为纤维组织状物填充，组织学切片可见为原纤维覆盖，C组软骨缺损处为类透明软骨组织填充，组织切片可见类软骨细胞及其周围的陷窝，电镜下可见细胞周围大量胶原纤维，C组在各个时期与A组、B组的评分比较差异都具有统计学意义(P<0.01)，示C组修复效果较其他两组为优。结论单纯脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶可有效修复

3、关节软骨全层缺损。 【关键词】  脂肪源干细胞 海藻酸钙 软骨    Abstract: ObjectiveTo evaluate the effect of not induced adipose derived stem cells(ADSCs)with calcium alginate healing full-thickness cartilage defects of rabbit knee after the model was made in center of femoral facies patellaris artificially,

4、 in order to find a simple and working way of articular cartilage defect restoration. MethodTwenty-seven New Zealand white rabbits were divided in to A, B, C groups randomly. Calcium alginate was transplanted to cartilage defect position of rabbits of group A, nothing for group B and calcium alginat

5、e with not induced ADSCs for group C. The animals were killed in 4th, 8th and 12th week later.Restored tissue was evaluated using naked eyes, histological section and transmission electron microscopy, score was given according to modified Wakitani grade standard. The total score was analyzed with st

6、atistic software SPSS 11.5. ResultArticular cartilage defects of the animal of groups A and B were filled with fibrous tissue which contains protofiber when it was checked using histological  section  and  microscopy.The  defect was filed with chondrocyte-like tissue .Chondrocyte

7、-like cells surrounded with lacunes were observed in histological section. Plenty of collagen fibers around cells could be seen under transmission electron microscopy. Group C had a significant statistical difference compared with groups A and B (P<0.01) in each period which showed that group C g

8、ot a better indication than other two groups.ConclusionNon-induced ADSCs with calcium alginate could repaire full-thickness cartilage defect of rabbit knee effectively.    Key  words：ADSCs;  calcium alginate;  cartilage    关节软骨的自身修复能力有限，其损伤后的修复一直是骨科界的难题之一

9、。随着干细胞培养技术和组织工程技术的不断进步，多种组织工程方法被应用来探索软骨缺损治疗的可行性。2001年Zuk PA和Zhu Min1等从人脂肪组织悬液中第一次分离获得了多向分化干细胞。目前已证实脂肪组织来源干细胞（adipose derived stem cells,ADSCs）能向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向诱导分化2。本实验将单纯脂肪源干细胞复合藻酸钙凝胶载体填充修复兔膝关节全层软骨缺损，对实验结果进行观察分析，以探讨单纯脂肪源干细胞应用于关节软骨缺损修复的可行性，为关节软骨缺损修复探索简单有效的途径。    1  材料和

10、方法    1.1  实验材料    (1)超净工作台(JHT-DDC型，济南康宝净化设备有限公司)；(2)恒温孵育箱(Heraeus公司，德国)；(3)倒置相差显微镜(Nikon TE2000，日本)；(4)50 ml培养瓶(Corning公司，美国)；（5）低温高速离心机（Heraeus公司，德国）。    (1)DMEM培养基(Gibco公司，美国)；(2) 型胶原酶(Sigma公司，美国)；(3)胰蛋白酶(上海华美公司，中国)；(4)胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)；(5)D

11、-Hanks平衡盐（Sigma公司，美国）；（6）海藻酸钠（上海化学试剂站分装厂）；（7）氯化钙（上海生工生物工程有限公司）。    2  实验方法    2.1  脂肪源干细胞的获取、培养和鉴定    将新西兰大白兔致死，无菌取双侧髂窝处脂肪组织约10 ml，用2倍体积D-Hanks平衡盐液漂洗3遍，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入0.2%型胶原酶5 ml置于37温箱内消化0.5 h，低温高速离心机内1 000 r/min离心10 min弃上清，加入16

12、0 mmol/L NH4Cl约5 ml裂解红细胞10 min，筛网过滤，按8 000个/cm2种植于50 ml培养瓶中。培养瓶置于37体积分数为5%的CO2恒温孵育箱内。24 h后首次换液，去除残余红细胞及未贴壁细胞，后每隔23 d换液一次，融合达80%以上时传代，动物实验用细胞传至第4代。取部分2代细胞采用含10%FBS，0.1 mol/L地塞米松，50 mol/L维生素C，10 mmol/L -甘油磷酸钠，100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素的DMEM诱导培养基向成骨细胞方向诱导。    2.2  动物实验   

13、; 选择健康成年新西兰大白兔27只（购自山东鲁抗实验动物中心），体重2.53.5 kg，雌雄不限。编号后随机分成A、B、C 3组，每组9只，双膝均用于实验。10%水合氯醛耳缘静脉麻醉，取双侧膝关节内侧切口，将髌骨推向外侧，进入关节腔。分别于左右两侧用直径3.5 mm的钻头在髌股关节面中心造成全厚关节软骨缺损，深度以点状出血为止，约2.5 mm。A组：（18膝）缺损处单纯置入海藻酸钙凝胶。B组：（18膝），空白对照，缺损处不作任何处理。C组：（18膝），置入培养的脂肪源干细胞海藻酸钙凝胶复合物，细胞最终浓度不低于2.0×106 ml。术毕兔清醒后，放置笼内自由活动，青霉素肌注连续5 d

14、。    2.3  检测方法    生物学特性观察：观察细胞生长情况；取部分2代细胞制成细胞爬片做油红O染色；另取部分向成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做Von Kossa染色观察矿化结节，以证实所培养细胞有无干细胞特性。    分别于术后4、8、12周处死动物，取材行大体、光镜组织学检查及电子显微镜下观察。(1)大体观察：膝关节滑膜有无充血水肿，关节囊有无粘连及修复组织的平整度、光泽度；(2)组织学检测：将标本脱钙、梯度酒精脱水，常规石蜡包埋、切片，HE染色和甲苯胺兰染色，进行光镜下组织

15、学观察；（3）透射电镜观察：取12周修复组织，包埋后超薄切片，观察细胞及基质情况。    2.4  统计学分析    根据改良的Wakitani评分标准(见表1)采用盲法对各标本进行组织学评分。每一标本均有3人进行评分，取均数，所得评分结果应用SPSS 11.5统计软件进行多因素方差分析，与对照组比较采用Dunnett检验。表1  软骨缺损修复的组织学评分标准指标组织学表现评分   3  结果    3.1  脂肪源干细胞培养及诱导