蛋白质及蛋白质、DNA相互作用研究方法加实例

1、蛋白质及蛋白质、蛋白质及蛋白质、DNADNA相互相互作用研究方法加实例作用研究方法加实例 蛋白质与蛋白质的相互作用的研究方蛋白质与蛋白质的相互作用的研究方法法 酵母双杂交系统酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid Systerm 免疫共沉淀免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP) GST pull-down 技术技术 荧光共振能量转移荧光共振能量转移Fluorescent Resonant Energy Transfer （FRET） 双分子荧光互补（双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescent Complement）BIFC 蛋白质芯片

2、技术蛋白质芯片技术 其它方法其它方法酵母双杂交系统酵母双杂交系统 1.1 酵母双杂交技术的原理酵母双杂交技术的原理 酵母双杂交系统由酵母双杂交系统由Fields和和Song等首先在研究真核基因转录调等首先在研究真核基因转录调控中建立。他的产生是基于对酵母转录因子控中建立。他的产生是基于对酵母转录因子GAL4性质的研究性质的研究. 基因转录不仅需要有特定的基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构，而且顺式序列结构，而且也需要有反式转录激活因子的参与。也需要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中其

3、中有有DNA结合结构域结合结构域(DNA binding domain, DB)和转和转录激活结构域录激活结构域(activation domain, AD), 它们都是转它们都是转录激活因子发挥功能所必需的。录激活因子发挥功能所必需的。 单独的单独的BD或或AD都不能激活基因转录，但不同转录激都不能激活基因转录，但不同转录激活因子的活因子的DB和和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。激活转录的功能。 如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两个蛋白分别与个蛋白分别与DB和和AD形成的融合蛋白。形成的融合

4、蛋白。 与与DB 融合的蛋白称为融合的蛋白称为“诱饵诱饵”(bait)， 与与AD融合的蛋白称为融合的蛋白称为“猎物猎物”(prey)。 如果这两个蛋白能发生相互作用如果这两个蛋白能发生相互作用, 这两个融合蛋白上的这两个融合蛋白上的DB和和AD就能重新形成有活性的转录激活因子就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活从而激活报告基因报告基因(reporter gene)的转录与表达。的转录与表达。 通过检测报告基因的表达产物通过检测报告基因的表达产物, 可判别可判别“诱饵诱饵”和和“猎猎物物”这两个蛋白质之间是否存在相互作用。这两个蛋白质之间是否存在相互作用。 1.1 1.1 酵母双杂交技

5、术的原理酵母双杂交技术的原理同时将上述两种载体转化改造后的酵母，同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生产生GAL4，又不能合成，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应

6、筛选，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。到阳性菌落。1.2 1.2 酵母双杂交操作主要流程酵母双杂交操作主要流程1. 分别构建分别构建BD和和AD融合蛋白载体融合蛋白载体2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞分别将重组载体转化酵母菌细胞3. 对酵母转化子进行自激活检测对酵母转化子进行自激活检测4. 将重组载体共转化酵母菌细胞将重组载体共转化酵母菌细胞5. 检测报告基因表达产物检测报告基因表达产物6. 分析酵母双杂交实验结果分析酵母双杂交实验结果BDADBDADBDADxYIdentification and Characterization of FAM124B as a Novel Co

7、mponent of a CHD7 and CHD8 Containing Complex实例实例Method：For yeast two hybrid studies we generated the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (transcript variant 1) and FAM124B-1,2-pGADT7 (transcript variant 2)FAM124B-1,3-pGBKT7 (transcript variant 1, FAM124B-1,2-pGBKT7 (transcript variant ),These both plasmi

8、ds were co-transformed into Y2HGold strain cells together with either the CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181) or the CHD8-pGBKT7 (amino acids 17892302) plasmids. Tserendulam Batsukh, Yvonne Schulz,et.al.Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Cont

9、aining Complex.PLoS One. 2012; 7(12): e52640Yeast two hybrid assay.Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181, demonstrating no direct interaction between FAM124B transcript variant 1 and t

10、he CHD7 part, while (B) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 17892302, shows a direct interaction. The same experiments were performed for FAM124B transcript variant 2. (C) Direct yeast two hybrid ex

11、periment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181, (D) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 17892302, FAM124B transcript

12、variant 2 interacts directly with the CHD8 part, while no direct interaction with the CHD7 part could be observed. 酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析蛋酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析蛋白质相互作用的技术。主要有二类载体白质相互作用的技术。主要有二类载体: a 含含DNA -binding domain的载体的载体; b 含含Transcription-activating domain的载体。另外还需要特殊的酵的载体。另外还需要特殊的酵母菌株如母菌株如GAL4缺陷型。缺陷型

13、。1.3 1.3 应用应用 它可用于：它可用于：检验检验蛋白质间的相互作用；蛋白质间的相互作用；分析分析蛋白质相互作用的结构域；蛋白质相互作用的结构域；发现发现新的作用蛋白质。新的作用蛋白质。 1.4 酵母双杂交技术的优点：酵母双杂交技术的优点：是一种细胞内蛋白质相互作用研究技术，比体外的蛋是一种细胞内蛋白质相互作用研究技术，比体外的蛋白质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。白质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。基于基因重组技术和分子遗传学的原理，更便于观察基于基因重组技术和分子遗传学的原理，更便于观察和检测实验结果。和检测实验结果。酵母菌是一种低等真核微生物，能反映真核生物的基酵母菌是

14、一种低等真核微生物，能反映真核生物的基本生命现象和规律。本生命现象和规律。4. 酵母菌生长迅速、容易培养，便于进行高通量、大规酵母菌生长迅速、容易培养，便于进行高通量、大规模的组学研究。模的组学研究。1.5 酵母双杂交技术的弱点：酵母双杂交技术的弱点：1. 假阳性：自激活、多因子参与假阳性：自激活、多因子参与假阴性：毒性蛋白、膜蛋白、难表达的蛋白假阴性：毒性蛋白、膜蛋白、难表达的蛋白低等真核细胞不能完全等同于高等真核生物的情况低等真核细胞不能完全等同于高等真核生物的情况 酵母双杂交实验的结果必须经过多方面的验证，包括：酵母双杂交实验的结果必须经过多方面的验证，包括：体外相互作用验证体外相互作用

15、验证 体外亲和纯化（体外亲和纯化（GST pull-down）、体外免疫共沉）、体外免疫共沉淀淀哺乳动物细胞内验证哺乳动物细胞内验证 亚细胞共定位、体内免疫共沉淀亚细胞共定位、体内免疫共沉淀优点：生理条件下的结合优点：生理条件下的结合缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用二、免疫共沉淀二、免疫共沉淀2.1 定义及原理定义及原理 免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：）：是以抗体是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法

16、。是确定两种蛋白质在完整细胞内互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。生理性相互作用的有效方法。 原理：原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀的抗体免疫沉淀x，那么与，那么与x在体内在体内结合的蛋白质结合的蛋白质y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的

17、新的作用搭档。定蛋白质的新的作用搭档。2.2 方法方法1) 收获培养的细胞（收获培养的细胞（11071108）冷）冷PBS洗涤洗涤2次次2）细胞裂解液裂解细胞，冰浴）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min3) 12000rpm 离心离心 30min4）收集上清并加入适量抗体，）收集上清并加入适量抗体，4C摇动摇动1h过夜过夜5）加入）加入ProteinA/G-Sepharose(琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶)悬液，悬液， 4C摇动摇动1h6）细胞裂解液洗涤）细胞裂解液洗涤ProteinA/G-Sepharose混合液混合液7）离心弃上清）离心弃上清8）沉淀加）沉淀加2蛋白蛋白Loading Buffer煮

18、沸煮沸510min9）离心，上清液跑）离心，上清液跑SDS-PAGE 胶胶10）考马氏亮兰染色、银染）考马氏亮兰染色、银染 Western Blot 质谱分析质谱分析1）细胞裂解）细胞裂解 采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。经验确定。 不能用高浓度的变性剂（不能用高浓度的变性剂（0.2SDS)，细胞裂解液中要，细胞裂解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂，如

19、商品化的加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的cocktailer。2）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。3) 对照实验的设计。对照实验的设计。Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex实例实例(A) Using the anti-CHD8 (abcam, ab84527) or the anti-CHD7 (abcam, ab31824) antibody for precip

20、itation, we detected with the anti-HA antibody (Roche) an approximately 51 kDa band corresponding to the estimated size of FAM124B transcript variant 1. Lane 1: co-transfected Co-IP, lane 2: untransfected HeLa cells as negative control.三、三、GST pulldown技术技术 3.1 定义及原理定义及原理定义：该技术是通过以适当标签定义：该技术是通过以适当标签

21、和目的基因进行融合和目的基因进行融合表达作为诱饵从细胞提取物中钓出与目的蛋白相互作表达作为诱饵从细胞提取物中钓出与目的蛋白相互作用的蛋白。多组分蛋白质复合物的分离主要利用固定在用的蛋白。多组分蛋白质复合物的分离主要利用固定在琼脂糖树脂的反标签系统完成。琼脂糖树脂的反标签系统完成。原理：将诱饵蛋白质和用谷胱甘肽原理：将诱饵蛋白质和用谷胱甘肽-s-转移酶转移酶(glutathione-transferase，GST）标签融合表达，一步）标签融合表达，一步纯化后与含有目的蛋白质的溶液进行孵育利用纯化后与含有目的蛋白质的溶液进行孵育利用谷胱甘谷胱甘肽琼脂糖球珠肽琼脂糖球珠将将GST-融合蛋白融合蛋白-

22、目的蛋白复合物沉淀下来，目的蛋白复合物沉淀下来，然后进行聚丙烯酞胺凝胶电泳然后进行聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDSPAGE) 鉴定与诱饵鉴定与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质蛋白质相互作用的蛋白质 两种应用：两种应用： 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用知蛋白质间可疑的相互作用3.2 方法：方法： 1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一单一明确的重组蛋白；明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；，细胞裂解蛋白

23、混合液；c, 体外翻体外翻译译cDNA表达得到的未知蛋白）表达得到的未知蛋白） 2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4C 2h 3）离心弃上清）离心弃上清 4）沉淀加入）沉淀加入2 蛋白蛋白Loading Buffer煮沸，离心煮沸，离心 5）取上清进行）取上清进行SDS-PAGE电泳，电泳， 6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做质谱分析确定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白注意：

24、该实验设立注意：该实验设立GST对照，反应均在对照，反应均在4C进行进行右边为右边为GST对照对照3.3 GST 融合蛋白沉降实验结果CK2GST-TP1GST Fig 10 GST pull down assay M: protein molecular weight standard Lane 1: GST Lane 2: GST-TP1+ CK2 Lane 3: CK23.4 GST pull-down技术优缺点优点：优点：融合蛋白亲具有高通量性、高选择性的特点，由于融融合蛋白亲具有高通量性、高选择性的特点，由于融合蛋白的多样性以及表达系统的多样性合蛋白的多样性以及表达系统的多样性(如细

25、菌、果如细菌、果蝇、哺乳动物蝇、哺乳动物)，该方法能够研究蛋白质在复杂体系中，该方法能够研究蛋白质在复杂体系中的相互作用。的相互作用。缺点：缺点：该方法的成功应用取决于是否能够得到足够多，并且该方法的成功应用取决于是否能够得到足够多，并且保持蛋白质活性的重组融合蛋白，以及如何避免内源保持蛋白质活性的重组融合蛋白，以及如何避免内源性诱饵蛋白的干扰。性诱饵蛋白的干扰。 四、荧光共振能量转移四、荧光共振能量转移（FRETFRET） Fluorescence resonance energy transfer4.1 4.1 荧光信号的产生荧光信号的产生 荧光基团在某波长的激发光刺激下，产荧光基团在某波

26、长的激发光刺激下，产生一个更长波长的发射光。生一个更长波长的发射光。4.2 4.2 什么是什么是FRET? FRET? 荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm10nm范围以内时，就会发生一种范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即非放射性的能量转移，即FRETFRET现象，使得供体的荧光强度比它单独现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的

27、多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽化荧光）实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。4.3 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白 60年代，年代，Shimomura等首先从水母等首先从水母（Aequoria Victoria ）中分离出一种水母发光）中分离出一种水母发光蛋白蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母中提取的颗粒都呈绿产生蓝色荧光。然而水母中提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光色，后经证实在水母体

28、内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白蛋白即绿色荧光蛋白 GFP, 后经研究表明，在水后经研究表明，在水母体内母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激在蓝光的激发下，产生绿色荧光发下，产生绿色荧光 。 人们在人们在GFP基因的基础上已经制造出蓝色荧光蛋白，黄基因的基础上已经制造出蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，青色荧光蛋白，又发现了红色荧光蛋白色荧光蛋白，青色荧光蛋白，又发现了红色荧光蛋白。其中兰色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，其中兰色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白之间可以青色荧光蛋

29、白和黄色荧光蛋白之间可以发生荧光共振能量转移发生荧光共振能量转移Tsien & Miyawaki采用FRET技术检测细胞内Ca2+的浓度变化。他们将CFP和YFP分别于钙调蛋白和钙调蛋白结合肽融合表达于同一个细胞内。当细胞内具有高的Ca2+浓度时，钙调蛋白和钙调蛋白结合肽结合，可诱发FRET，使受体蛋白YFP发出黄色荧光，因此细胞呈黄色。当细胞内Ca2+浓度低时，FRET几乎不发生，因此检测时CFP被激发，发出绿色荧光，细胞呈绿色。4.4 应用 在生命科学领域，在生命科学领域，FRET技术是检测活体中生技术是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力物大分子纳米级距离和纳米级

30、距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。正如前述，当供体是否存在直接的相互作用。正如前述，当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在并且两个探针的距离在10nm范围以内时，就范围以内时，就会产生会产生FRET现象。而在生物体内，如果两个现象。而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离在蛋白质分子的距离在10nm之内，一般认为这之内，一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。两个蛋白质分子存在直接相互作用。五、双分子荧光互补技术（五、双分子荧光互补技术（B

31、iFC） (Bimolecular Fluorescence Complementation)基本原理：方法利用绿色荧光蛋白基本原理：方法利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)及其突变体的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个及其突变体的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接.如果两个如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光片段在空间上

32、相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光.在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱等情况。发生的时间、位置、强弱等情况。 将荧光蛋白分割成两个将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子不具有荧光活性的分子片段片段分别与目标蛋白连接分别与目标蛋白连接.如果两个目标蛋白因为有相互作如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，个分子片段在

33、空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出重新形成活性的荧光基团而发出荧光荧光Identification of the SIRTUIN1 (SIRT1)-binding domain of BMAL1. Binding of SIRT1 to BMAL1 deletion mutants was analyzed by bimolecular fluorescence complementation (BiFC). COS7 cells were transfected with plasmids encoding SIRT1-N-terminal of Venus (VN) and BM

34、AL1-C-terminal of Venus (VC) wildtype (WT) or its various mutants (nuclear localization sequence NLS, BMAL1 without a functional nuclear localization signal; basic-helix-loop-helix bHLH, encoding BMAL1 71 to 140; Per-Arnt-Sim PAS-A, BMAL1 210 to 320; PAS-B, BMAL1 350 to 480; transcriptional activati

35、on domain TAD, BMAL1 553 to 625). The images were captured by fluorescence imaging microscopy using specific filter sets for yellow fluorescent protein and red fluorescent protein. 六、蛋白质芯片技术六、蛋白质芯片技术 蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合

36、的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点的相互作用蛋白点 。Gong W. et al. (2008) Molecular Plant1: 27-41.其它蛋白互作技术其它蛋白互作技术串联亲和纯化（串联亲和纯化（TAP） 表面等离子共振（表面等离子共振（SPR） 噬菌体展示技术噬菌体展示技术(phage display approach) 融合蛋白亲和色谱法融合蛋白亲和色谱法(protein fusion affinity chromatography) 原子作用力显微技术原子作用力显微技术(atomic force mi

37、croscopy, AFM ) 蛋白质与蛋白质与DNA相互作用相互作用 （一）酵母单杂交系统（一）酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system） 该技术是上世纪该技术是上世纪90年代中发展起来的研究年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之蛋白质之间相互作用的新技术，在酵母细胞内研究真核生物中间相互作用的新技术，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。序列相互作用蛋白的编码基因。基本原理：基本原理：将顺式作用元件与最基本启动子（将顺式作用元件与最基本启动子（minimal promoter，Pmin）相连并将报告基因连到）相连并将报告基因连到Pmin下游，将待下游，将待测转录因子测转录因子cDNA与酵母转录激活结构域（与酵母转录激活结构域（transcription-activating domain, AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就激活因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就激活Pmin启动启动子，报告