RTPCR详细图文解析

1、一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 3、如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线 ：（2） 荧光阈值： （3）Ct值：

2、60;    CT值的重现性： 5、定量原理：理想的PCR反应：   X=X0*2n非理想的PCR反应：  X=X0 (1+Ex)n      n：扩增反应的循环次数      X：第n次循环后的产物量      X0：初始模板量      Ex：扩增效率5、标准曲线 6、绝对定量1）确定未知样品的 C(t)

3、值2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量 7、DNA的荧光标记： 二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green  能结合到双链DNA的小沟部位     2、SYBR Green  只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。  PCR反应体系的建立及优化: 1、SYBR Green 使用浓度:太高

4、抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定；2、 基因型的分析；3、 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。（三）优点及缺点优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA； 使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；

5、便宜。 缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；   对引物特异性要求较高。方法二：TaqMan-水解型杂交探针  *5端标记有报告基团(Reporter, R)  ，如FAM、VIC等 *3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)* 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光*Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针（一）工作原理 注意：每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光PCR反应的建立：1

6、、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 ，<30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-602、反应参数的确定：一般为：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度72 ，45 S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值  引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同（二）优缺点优点：对目标序列的高特异性        -阴性结果确定设