体内构建骨软骨复合体修复骨软骨缺损的实验

1、体内构建骨软骨复合体修复骨软骨缺损的实验    【摘要】探讨软骨组织工程方法修复骨软骨缺损理想的种子细胞和支架材料。方法体外诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞定向分化，分别与PLGA支架复合培养，并模仿马赛克骨软骨移植术在犬关节骨软骨缺损深层置入MSC支架复合体，浅层置入诱导培养后的MSC支架复合体，紧密压配，体内构建骨软骨复合体，观察其修复的情况。结果16周实验组缺损区完全由透明软骨修复，与周围正常软骨完全融合，组织观察显示以软骨细胞修复为主，软骨下骨形成，潮线基本恢复；阴性对照组缺损区主要由纤维组织修复，部分由透明软骨修复，组织观察显示以纤维细胞修复为主，

2、混有部分软骨细胞；空白对照组完全由纤维组织修复。结论MSCs经向软骨细胞定向分化后复合PLGA支架材料，通过紧密压配方式与MSCsPLGA支架在体内构建骨软骨复合体，可以有效修复骨软骨缺损。关节软骨损伤是骨科临床的常见疾病，以往临床使用的治疗方法均难以达到理想的要求。组织工程技术的迅速发展，为这一难题的解决提供了前所未有的机遇。本实验研究的目的是采用软骨组织工程技术，体外分离骨髓间充质干细胞（MSCs）为种子细胞，经软骨细胞诱导生长因子的诱导培养后，与聚羟基乙酸（polyglycolicacid，PLA）聚乳酸（polylacticacid，PGA）共聚物(PLGA)支架材料复合培养，并模仿马

3、赛克骨软骨移植术在犬膝关节骨软骨缺损深层置入MSC支架复合体，浅层置入诱导培养后的软骨细胞支架复合体，紧密压配，体内构建骨软骨复合体，观察其修复的情况。期望能够找到软骨组织工程理想的种子细胞和支架材料。1材料和方法1.1材料1.2方法说明书进行操作，型胶原阳性的细胞，胞浆着色呈黄色或棕黄色（表2）。表1细胞因子对MSCs分泌糖胺聚糖（GAG）的检测表2型胶原免疫组化阳性细胞数（个/视野）2结果2.1细胞形态学改变倒置相差显微镜观察发现，原代细胞接种后13d可见少量细胞贴壁，呈短梭形。3d后出现细胞集落，78d广泛集落形成。1214d细胞形成单层。传代细胞贴壁快，78d形成单层，细胞核大，胞浆内

4、颗粒多。加入细胞因子后，细胞生长明显加快，体积增大，胞体变圆，呈漩涡状生长；2.2实验组MTT吸光度值、培养上清液中的糖胺聚糖（GAG）含量和型胶原分泌均明显高于对照组。型胶原免疫组化阳性的MSCs胞浆染色为黄色或棕黄色(图1、2)。2.3电镜观察扫描电镜显示PLGA支架呈不规则多孔状，孔径控制在200300m，孔径率85%，孔壁厚度较均匀,为2040m。复合材料显示MSCs细胞在PLGA支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以见到细胞分泌的基质和细胞伪足的铆固作用(图3)，表明支架材料具有良好的细胞亲和性。2.4动物实验结果大体观察。术后12周：A组新生组织表面平整、光滑，与周围软骨界线模糊，端面

5、显示软骨厚度与正常软骨相近；B组修复高度较周围软骨水平相近，但软骨层厚度比A组明显偏薄，无光泽，与周围软骨界线尚清楚；C组部分接近正常修复高度，修复组织呈黄色，局部凹陷。术后16周，A组缺损修复区组织与周围关节软骨相整合，软骨缺损区被光滑白色半透明的组织覆盖，与周围软骨组织外形无差异(图4)；B组缺损区修复组织与周围软骨部分整合在一起，光泽较差(图4)；C组缺损处修复组织低凹新生组织软，无光泽，与周围软骨组织区别明显。组织学观察。术后12周：A组缺损区形成透明样软骨组织，比周围正常软骨偏厚，软骨细胞数量多，出现明显的规律，表面层的软骨细胞平行关节面排列，深层纵向排列，软骨基质染色较四周时淡，软

6、骨下骨丰富。B组边缘区厚度与周围正常软骨接近，软骨细胞排列不规则，与周围软骨结合可，无明显裂隙存在。近中央区仍以纤维组织修复为主，细胞数很少，局部有裂隙。C组表面为纤维组织，细胞成分较少。术后16周，A组缺损区软骨厚度与正常软骨组织接近，细胞排列出现明显规律，表面层的软骨细胞平行关节面排列，深层纵向排列，与透明软骨组织相似，软骨下骨形成，潮线基本恢复，与周围正常软骨连接较好(图5)。B组软骨细胞排列不规则，中央修复区大部分为纤维组织修复(图6)。C组缺损区内主要为纤维组织(图7)。2.5统计学分析采用SPSS10.0统计软件包分析，数值以±s表示，以P0.05表示差异有显著性意义。表

7、3关节软骨缺损的组织学评分标准表4各组软骨修复组织学评分结果各时间段A组与B组、C组比较均有显著性差异，*P0.05。3讨论有研究认为对于微环境尚未受到严重破坏的组织修复或再生治疗，不需要进行体外诱导即可用干细胞直接移植修复，而对于缺损或微环境严重受损的组织修复或再生治疗，则需要对干细胞进行定向诱导后移植1。作者的实验结果表明，在体外对MSCs进行诱导培养，(1)可以使细胞扩增；(2)可以向软骨细胞定向分化。在体外构建成熟的组织工程化软骨，是在模拟体内微环境的条件，探索和研究软骨种子细胞在支架内黏附、增殖及种子细胞与支架材料的相容性即软骨形成的条件、机制的问题。作者把细胞PLGA支架复合体在体

8、外培养1周后，塑成圆柱状，采用马赛克移植方法植入缺损部位，底部为MSCs?PLGA支架复合体，表层部分为诱导培养的MSCs?PLGA支架复合体。在体内微环境的作用下，迅速生成软骨组织。在12周时，软骨组织已充满了整个缺损区，随后深层软骨组织逐渐被软骨下骨替代。16周时软骨细胞出现分层排列，与周围正常组织无明显差别。在制造骨软骨缺损模型的时候，损伤区会释放生物活性因子，包括TGF?、IGF?1和BMP2。早期复合组织植入缺损部位后，在这些细胞因子的作用下，经诱导的MSCs细胞在PLGA支架材料中迅速增殖，表层的复合体在关节内滑液细胞因子和周围软骨组织微环境的作用下形成早期软骨组织。而深部的复合体

9、被来自于损伤区的血管组织侵入，机体的MSCs细胞和诱导植入的MSCs细胞，在局部微环境的作用下，形成骨组织软骨下骨，从而完成骨软骨缺损组织的修复。这种修复的特点是软骨与软骨下骨形成坚固的自然连接，软骨下骨与软骨同时获得修复。但是作者某些切片中观察到2种复合体之间有裂隙、整合差，但深部复合体与软骨下骨的结合均良好。尽管很多专家学者在体内、体外均成功构建出骨软骨复合组织37,但是存在以下问题:(1)无论在体外或体内,构建组织的骨、软骨界面结合欠佳；（）植入软骨与周围宿主软骨组织整合欠佳；(3)形成的软骨组织质量缺陷:透明软骨比例少,缺乏正常关节软骨的分层结构,缺乏表浅的扁平细胞层和潮标等；（）更为

10、重要的是,以上构建的骨软骨复合组织只是短期观察有证据初步表明在形态学、生化成分等方面具有骨软骨组织结构,其生理功能、机械性能、能否长期持续存在等尚待进一步研究证实。为了改善骨软骨复合组织的结构和界面形成情况,设计一体化、呈梯度变化的双层支架材料将更为有利。Sherwood等8应用TheriForm三维打印方法研制出一种新型的骨软骨三维支架,在骨、软骨端配件交界区组成成分含量、气孔率等方面形成梯度变化,这样可以避免支架在体外培养和体内植入时发生界面分层而有利于新生的骨与软骨组织之间形成良好界面。本实验结果证实：MSCs适合成为软骨组织工程的种子细胞。取材方便，体外培养性能稳定，易于传代扩增，在一定诱导条件的培养下，可以分化为软骨细胞。TGF?1在促进MSCs细胞增殖和向软骨细胞定向分化方面有显著的作用。PLGA支架是理想的软骨组织工程支架材料，具有良好的孔隙率和组织相容性，MSCs在其中可以很好地黏附、扩展和增殖。MSCs经向软骨细胞定向分化后复合PLGA支架材料，通过紧密压配方式与MSCsPLGA支架在体内构建骨软骨复合体，可以有效修复骨软骨缺损。图1对照组MSCs免疫组化结果阴性，胞浆内未见到棕褐色颗粒图2实验组MSCs免疫组化结果呈阳性，胞浆内见有棕黄色颗粒图3细胞在支架材料上黏附、增殖，形成细胞团，借伪