实验四 逆转录PCR RTPCR

1、实验四 逆转录PCR (RT-PCR)【实验目的】1了解用逆转录PCR法获取目的基因的原理。2学习和掌握逆转录PCR的技术和方法。【实验原理】聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106 倍。RT-PCR将以RNA为模板的cDNA（complement DNA）合成（即RNA的反转录（RT，reversetranscription），同cDNA的PCR结合在一起的技术，提供了一种基因表达检

2、测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。由于cDNA包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。 RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。 RT-PCR的基本原理（图4.1）。首先是在逆转录酶的作用下从RNA合成 cDNA，即总RNA中的mRNA在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝

3、DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA（cDNA）；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为材料，在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段。 在RT时，有3种引物可选择 （表4.1) 。用1）和2）方法，理论上是扩增的所有的cDNA，还要用此产物做PCR的模板继续扩增。如果用3）方法，先要去查它的序列，并用oligo等软件设计引物。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测或克隆多个基因的mRNA时比较有用。在两步法RT-PCR中，

4、每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。而一步法RT-PCR具有其它优点（表4.2），cDNA合成和扩增反应在同一管中进行，不需要打开管盖和转移，有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用基因特异性引物(GSP)起始cDNA的合成。由图4.1不难看出，随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止

5、位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20l反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。 Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3'端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20l反

6、应体系使用0.5g oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。 基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA 3'最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。 已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样，可以插入到质粒或噬菌体中，为此，首先必需有适当的接头(Linker)，接头可以是在PCR引物上增加限制性内切酶识别位点片段，

7、经PCR扩增后再克隆入相应的载体；也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。 本实验是要从小鼠肝脏组织中获取Fas配体基因，Fas配体(FasL)是一分子量约为40u的II型跨膜糖蛋白，属TNF家族成员。活化的T细胞可表达Fas和FasL，并通过Fas/FasL系统介导细胞凋亡作用，保持机体免疫系统的自稳态。近年研究发现在部分癌细胞中FasL表达增强，并与肿瘤的复发转移有关。我们采用RT-PCR方法克隆FasL全长cDNA并构建其表达载体，可以为进一步研究FasL的功能提供条件。在上下游引物的5端分别加上

8、了限制酶切位点及其保护碱基（即Hind III和BamH I），以便可以通过双酶切将目的片段定向的克隆到原核表达载体pGFPUv上（附录图4.3）。 为了便于后续实验可以用金属螯和层析的方法分离和纯化目的蛋白，我们改造了pGFPUv，在其上加了6×His标签。【试剂与器材】（一）试剂1.总RNA（或mRNA）2.RNA酶抑制蛋白（RNase Inhibitor） ：40 U/mL3.dNTP 混合物 (各10 mM)4.oligo(dT)12-18：2.5 mmol/L5.10*逆转录合成缓冲液（10´RT buffer）：250 mmol/L Tris-HCl (pH8.

9、3)，375 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl26.AMV逆转录酶 5u/mL7.基因特异性5和3引物各20 mmol/L 8.Tap DNA聚合酶 5u/mL9.10*PCR缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L TrisCl，在25下，pH9.0，1.0% Triton X-100，15mmol/L MgCl2。（二）器材1）PCR仪，2）PCR管，3）微量移液器【操作方法】（一）逆转录：1)建立RT反应体系：2)涡旋混匀，42反应1小时，95加热5分钟，然后置于冰上。（二）PCR扩增：1)建立PCR反应体系：2)将上述反应体系涡旋混匀, 按下列程序运行循

10、环： step2-4运行30个循环，其中复性温度主要依据引物的不同而不同。（三）取10-20uL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，余下的PCR产物-20保存。【注意事项与提示】1.逆转录反应过程，需建立无RNAase环境，以避免RNA的降解。2.成功的逆转录反应决定于高质量的模板RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。此外，RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的RNA分离方法，如Trizol Reagent，会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。因此在进行PCR反应时应该对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照反应

11、，以确定扩增出来的片段是来自基因组DNA还是cDNA。在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。3.RT-PCR的起始模板可是总RNA或mRNA，都可以检测到扩增结果（如下图）。另外，分离mRNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有基因时，使用mRNA会增加检测的灵敏度。4.在逆转录反应中经常加入RNA酶抑制蛋白以增加cDNA合成的长度和产量。RNA酶抑制蛋白要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。RNA酶抑制蛋白仅防止RNase A，

12、B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心试验者的手上Rnase对样品的污染。5.较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用经过改良的耐高温逆转录酶， 如：Invitrogen 公司的ThermoScript逆转录酶，使逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增。而且适当提高逆转录保温温度，可增加RT-PCR的特异性。6

13、.建立反应体系时，加完其它反应物后，才加模板DNA和Taq DNA聚合酶；然后将全部反应物涡旋混匀；上PCR仪前加矿物油封盖或设热盖。7.PCR反应的循环数一般25-30次就足够了，过多的循环数会造成非特异性扩增和时间的浪费。复性温度的计算，一般是在引物的Tm值上下浮动，Tm =2（A+T）+4（G+C）。适当提高复性温度可提高PCR扩增的特异性。8.不管是反转录反应还是PCR反应都应先调制试剂的Master Mix (包括RNase Free dH2O、缓冲液、dNTP Mixture等)，然后分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂的体积更准确，减少试剂的损失，避免重复分取同一试剂，同时也可

14、以减少实验操作造成的误差。而且分装试剂时务必用新Tip，以防止样品间的污染。 9.AMV、RNase Inhibitor、Taq等酶类，要轻轻地混匀，避免起泡。分取之前要轻轻地离心收集到反应管底部，因其粘度高，所以要慢慢地分取。 酶类务必在实验前从-20取出，使用后立即放回-20保存。 10.最佳的PCR条件，因PCR扩增仪的不同而不同，所以在使用您的样品之前最好先做Control反应，以确定最佳的PCR条件。为延长PCR仪的使用寿命，应尽可能缩短PCR仪4保存的时间，尽量避免4过夜的情况。Lane 1：总RNA 的 RT-PCR 产物（人细胞调亡因子TF15基因） Lane 2： mRNA 的 RT-PCR 产物，人细胞调亡因子TF15基因 Lane 3： 10