第二章酶发酵工程改桂

1、第二章酶发酵工程改桂第二章酶发酵工程改桂酶的发酵工程Enzyme Engineering 第一节第一节 酶生物合成的调节机制酶生物合成的调节机制1、原核生物中酶生物合成的调节 原核生物酶的合成主要是在转录水平上进行调节，原核生物酶的合成主要是在转录水平上进行调节，调节方式主要有酶合成的诱导和酶合成的阻遏两种方式调节方式主要有酶合成的诱导和酶合成的阻遏两种方式。 原核生物中酶合成的诱导和阻遏作用机制都可以用原核生物中酶合成的诱导和阻遏作用机制都可以用Jacob和和Monod提出的操纵子理论来解释。提出的操纵子理论来解释。1、原核生物中酶生物合成的调节 （一）乳糖操纵子学说（一）乳糖操纵子学说 1

2、. 基本概念 操纵子：由调节基因（R）、启动子（P）、操纵基因（O）和结构基因（S）所构成的一个完整的基因表达单位。 诱导物：诱导酶起始合成的物质。 辅阻遏物：阻遏酶产生的物质。 调节蛋白：调节基因产生的一种变构蛋白。两个结合位点：操纵基因结合位点、效应物结合位点。两种类型：阻遏蛋白、阻遏蛋白原。（1 1）阻遏蛋白的负性调节）阻遏蛋白的负性调节IPOZYA- -半乳糖苷酶半乳糖苷酶透过酶透过酶乙酰基转移酶乙酰基转移酶诱导物诱导物阻遏蛋白阻遏蛋白cAMP-CAPRNA聚合酶聚合酶mRNA（2 2）CAP的正性调节的正性调节DNA1 1、原核生物中酶生物合成的调节、原核生物中酶生物合成的调节（二）

3、色氨酸操纵子学说（二）色氨酸操纵子学说磷酸核糖邻氨基苯甲酸磷酸核糖邻氨基苯甲酸分支酸分支酸邻氨基苯甲酸邻氨基苯甲酸羧苯氨基脱氧核糖磷酸羧苯氨基脱氧核糖磷酸吲哚甘油磷酸吲哚甘油磷酸色氨酸色氨酸邻氨基苯甲酸合酶邻氨基苯甲酸合酶邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶吲哚甘油磷酸合酶吲哚甘油磷酸合酶色氨酸合酶色氨酸合酶1 1、原核生物中酶生物合成的调节、原核生物中酶生物合成的调节1. 1. 操纵子的调节作用操纵子的调节作用RPODBACE阻遏蛋白原阻遏蛋白原辅阻遏物辅阻遏物（色氨酸）（色氨酸）mRNADNA1 1、原核生物中酶生物合成的

4、调节、原核生物中酶生物合成的调节2. 2. 衰减子的调节作用衰减子的调节作用RPODBACE低色氨酸低色氨酸高色氨酸高色氨酸前导序列前导序列4321DNA12435/ - mRNAPr43211 1、原核生物中酶生物合成的调节、原核生物中酶生物合成的调节1、原核生物中酶生物合成的调节 （三）酶生物合成的诱导作用（三）酶生物合成的诱导作用 酶的合成方式： 组成酶：细胞所固有的酶 诱导酶：在诱导物的诱导作用下合成的酶 诱导物 底物、产物、底物结构类似物（IPTG） 诱导作用 协同诱导：诱导物同时诱导几种酶的合成 顺序诱导：先后诱导不同酶的合成 生物学意义： 节约机制； 环境适应能力（四）酶生物合成

5、的阻遏作用（四）酶生物合成的阻遏作用1. 1. 终产物阻遏终产物阻遏 某一代谢（合成）途径的终产物阻遏合成途径中酶的合某一代谢（合成）途径的终产物阻遏合成途径中酶的合成的现象。成的现象。ABCDEE1E2E3E41 1、原核生物中酶生物合成的调节、原核生物中酶生物合成的调节1、原核生物中酶生物合成的调节 2. 2. 分解代谢物的阻遏作用分解代谢物的阻遏作用 当培养基中存在两种碳源（底物）时，容易利用的碳源的分解代谢产物阻遏分解代谢另一种碳源的酶的合成的现象。 葡萄糖效应：葡萄糖抑制微生物利用其他碳源（底物）的现象 。2、真核生物中酶生物合成的调节 （一）细胞分化改变酶的生物合成（一）细胞分化改

6、变酶的生物合成 如：端粒酶的生物合成 （二）基因扩增加速酶的生物合成（二）基因扩增加速酶的生物合成 如：爪蟾卵细胞形成时，rRNA的基因数增加4000倍；中国田鼠细胞培养在含有氨甲基蝶呤的培养基中生长时，细胞中编码二氢叶酸还原酶的基因大量扩增，以合成大量的二氢叶酸还原酶。2、真核生物中酶生物合成的调节 （三）增强子促进酶的生物合成（三）增强子促进酶的生物合成 增强子：是一段能够提高转录效率的特定DNA序列，长约100200bp，核心组件812bp，单拷贝或多拷贝串联存在。 增强子的作用特点： （1）提高同一条DNA链上基因的转录效率，可远距离发挥作用，在基因的上游或下游均可起作用。 （2）与其

7、序列的正反方向无关。 （3）要有启动子才能发挥作用，但对启动子没有严格的专一性。 （4）必须与特定的蛋白质因子结合才能发挥作用，具有组织和细胞特异性。3、酶生物合成调节作用机理应用 （一）发酵中的应用（一）发酵中的应用 枯草芽胞杆菌的鸟苷发酵是典型的代谢控制发酵，采用腺嘌呤营养缺陷型突变株。发酵过程中人为限制腺嘌呤浓度，使细胞代谢途径中的腺嘌呤类核苷酸浓度保持在不致引起关键酶的反馈抑制和阻遏的水平，有利于鸟苷的积累。枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌5-二磷酸鸟苷二钠二磷酸鸟苷二钠3、酶生物合成调节作用机理应用 （二）诱导酶生产中的应用（二）诱导酶生产中的应用 在培养基中加入诱导物诱导酶合成的例子非常多

8、，食品和饲料工业中应用的酶如：-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、植酸酶、葡萄糖异构酶、-半乳糖苷酶，它们均属于诱导酶，在酶的合成时必须在培养基中加入底物或底物类似物等诱导物时才会产酶。酶结构、诱导酶酶结构、诱导酶3、酶生物合成调节作用机理应用 （三）微生物选育中的应用（三）微生物选育中的应用 若通过基因工程手段和传统诱变的技术获得在抗代谢物（代谢物的结构类似物）存在时也能正常生长的突变株，则说明该突变株的相关酶系对这种抗代谢物不敏感，这也就解除了某些代谢物对有关酶系的反馈阻遏。通过基因工程手段的农作物通过基因工程手段的农作物酶的发酵工程Enzyme Engineering 第二节第二节

9、酶的酶的微生物微生物发酵技术发酵技术 利用微生物的发酵作用，运用一些技利用微生物的发酵作用，运用一些技术手段控制发酵过程，大规模产酶的技术，术手段控制发酵过程，大规模产酶的技术，称为酶的发酵技术。内容主要包括：菌种称为酶的发酵技术。内容主要包括：菌种的选育、培养基的配置、培养条件控制、的选育、培养基的配置、培养条件控制、发酵方法。发酵方法。酶的酶的微生物微生物发酵技术发酵技术 （一）产酶微生物的种类 1、细菌 大肠杆菌（E. coli） 一般产 主要的酶品种 谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶等 基因工程操作酶：限制性内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种

10、枯草杆菌（B. subtilis） 能产生多种 主要的酶品种 淀粉酶类：如-淀粉酶（胞外） 蛋白酶类：如中性蛋白酶（胞外） 磷酸酶类：碱性磷酸酶（细胞间质）、5-核苷酸酶等1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 （一）产酶微生物的种类 2. 放线菌 链霉菌（Streptomyces） 生产葡萄糖异构酶的主要微生物 主要酶品种 青霉素酰化酶、纤维素酶、 几丁质酶、 碱性/中性蛋白酶等 含有丰富的16-羟化酶 用于甾体药物转化1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 （一）产酶微生物的种类3. 酵母菌 假丝酵母属（Candida） 细胞呈圆形、卵形或长形 不产色素，在麦芽汁琼脂培养基上 菌落乳白色或奶油色

11、产酶品种 脂肪酶、尿酸酶、 转化酶、醇脱氢酶等 产17-羟化酶用于甾体药物转化 具烷类代谢的酶系 可利用石油及其加工废料为碳源1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 广泛应用于 细胞呈圆形、卵形、椭圆形，在麦芽汁培养基上菌落白色有光泽 产酶品种 醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、转化酶等1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 （一）产酶微生物的种类（一）产酶微生物的种类 4. 霉菌： 黑曲霉（Aspergillus niger） 主要酶品种 糖化酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、纤维素酶等 米曲霉（Aspergillus oryzae） 米曲霉中糖化

12、酶和蛋白酶活力较强，因此广泛应用于酿造行业和食品行业 主要酶品种 糖化酶、果胶酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、核酸酶等1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种黑曲霉黑曲霉（A. niger）1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种米曲霉米曲霉（A. oryzae） 红曲霉属（Monascus） 菌落成熟后产红色色素，颜色较深 腐生真菌，能耐受 pH 3.5 和 10% 酒精，尤嗜乳酸 红曲霉中含有丰富的酶系，并且自身能合成生长素，无须外源 供给，尤其是葡萄糖淀粉酶和蛋白酶等酶，在食品行业使用广泛 主要酶品种-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、酯酶等1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 青霉属（Penicillium）

13、属半知菌纲，也有的列入子囊菌纲 腐生真菌，存在于空气中及腐烂的物质表面 常用的工业发酵微生物，广泛用于有机酸、干酪和抗生素的生产 主要菌种和酶的种类 产黄青霉（Penicillium chrysogenum） 葡萄糖氧化酶、纤维素酶、果胶酶、青霉素酰化酶等 橘青霉（Penicillium citrinum） 脂肪酶、葡萄糖氧化酶、5-磷酸二酯酶、核酸酶等1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 青霉属（Penicillium）1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 木霉（Trichoderma） 属于半知菌亚门，丛梗孢目，木霉属，常见的木霉有绿色木霉、康宁木霉等 木霉具有较强分解纤维素能力，绿色木霉（T

14、. viride）通常能够分泌高活性纤维素酶，对纤维素的分解能力很强，因此在木质素、纤维素丰富的基质上生长快，传播蔓延迅速 菌落开始时为白色，致密，圆形，向四周扩展最后整个菌落全部变成绿色 产 的重要菌株；亦用于生产 17-羟化酶，可用于甾体药物转化1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 木霉（Trichoderma） 木霉适应性很强，菌落扩展很快，特别在高温高湿度条件下几天内木霉菌落可遍布整个料面1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种哈茨木霉哈茨木霉 (T. harzianum) 的显微形态的显微形态绿色木霉绿色木霉 (T. viride) 的菌落的菌落 根霉（Rhizopus） 具有 11-羟化酶

15、，是用于的重要菌株 产酶品种 糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等 毛霉（Mucor） 毛霉能糖化淀粉并能生成少量乙醇，产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，我国多用来做豆腐乳、豆豉 许多毛霉能产生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等 产酶品种 蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 根霉（Rhizopus） 毛霉（Mucor）1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 （二）产酶菌种的要求（二）产酶菌种的要求 （1）酶的产量高； （2）容易培养和管理，产酶细胞容易生长繁殖，适应性强，便于管理； （3）菌株遗传性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体

16、，保证生产的稳定性； （4）菌株能利用廉价原料，发酵周期短，生产成本低； （5）有利于酶产品的分离纯化，最好是分泌型的胞外酶； （6）菌株安全可靠，非病原菌，不产毒素及其它有害物质，不影响生产人员的身体健康；1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 （三）菌种筛选（三）菌种筛选 1. 含菌样品的采集 根据不同微生物的生态分布特点，从自然界中采样。 产酶微生物的分布基本规律： （1）相近菌种产生的酶性质一般相近或相似。 （2）胞外酶的稳定性和最适条件通常和菌的最适生长条件接近 （3）为获得能降解某种物质的产酶菌株，一般可从该物质分布比较丰富的地方寻找。1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 （三）菌种筛选

17、（三）菌种筛选 2. 菌种的分离纯化 平板划线法、稀释涂布分离法 3. 产酶性能的测定 初筛： 快速、简便；平板筛选法有色圈。 复筛： 精确；液体或固体培养发酵，测定产酶水平。1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 （三）菌种筛选（三）菌种筛选 4. 菌种的选育 （1）诱变育种 物理诱变：紫外线、射线、微波诱变等 化学诱变：亚硝基胍（NTG）、硫酸二乙酯（DES）等 空间诱变（特殊环境条件，如宇宙射线、高真空、微重力等） （2）代谢控制育种 营养缺陷型突变株、抗反馈调节突变株、耐性突变株 （3）原生质体融合育种 亲株细胞分别去除细胞壁后进行融合, 基因组间交换重组,获得融合子1 1、酶的生产菌种、

18、酶的生产菌种 （三）菌种筛选（三）菌种筛选 （4）基因工程育种 是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。 （5）基因组改组育种 是分子定向进化DNA 改组技术在全基因组水平的延伸。它将重组的对象从单个基因扩展到整个基因组，可以在更广泛的范围内对菌种的多种优良性状进行优化组合。1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 （三）菌种筛选（三）菌种筛选 5. 菌种的保藏 斜面低温保藏法、沙土管保藏法、石蜡油封藏法、真空冷冻干燥法、超低温保藏法、固体曲法等。 6. 菌种的退化与复壮 （1）菌种退化现象：随着菌种保藏时间

19、的延长或多次的转接传代，菌种本身所具有的优良遗传性状发生了不利于发酵生产的遗传变异现象。 （2）防止退化措施：创造合适的培养条件，采取有效的菌种保藏方法，尽量减少传代次数。 （3）退化菌种的复壮：纯种分离和性能测定。1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 （四）菌种活化与扩大培养（四）菌种活化与扩大培养 1. 菌种扩大培养 保藏菌种 试管斜面活化 三角瓶培养 种子罐培养 2. 种子制备的过程 防止杂菌污染，减少转接次数，避免种子培养基的长时高温灭菌；培养基及培养条件是细胞生长繁殖的最适条件；培养时间以对数生长期为宜。1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 （四）菌种活化与扩大培养（四）菌种活化与扩大培

20、养 3. 种子质量的控制 （1） 影响种子质量的因素及其控制 培养基 营养成分丰富，尽可能满足细胞生长繁殖； 营养成分尽可能与发酵培养基接近；pH值稳定 培养条件 必须是菌种细胞生长繁殖的最适条件；包括 温度、pH值、通气搅拌、通风、翻曲、湿度 种龄 生命力最为旺盛的对数生长期。细菌：724h; 霉菌：16 50h; 放线菌：2164h;1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 （四）菌种活化与扩大培养（四）菌种活化与扩大培养 3. 种子质量的控制 接种量 与菌种特性、种子质量和发酵条件有关。 种子质量的判断 细菌、酵母菌 菌体健壮，菌形 一致，均匀整齐，一定的排列和形态； 霉菌、放线菌菌丝粗壮，染

21、色力强，生长旺 盛，菌丝分枝和内含物情况良好。 种子的异常情况 菌种生长缓慢或过快，菌丝结团 1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 （四）菌种活化与扩大培养（四）菌种活化与扩大培养 3. 种子质量的控制 （2） 种子质量的控制措施 菌种稳定性检查：保藏菌种 无（杂）菌检查：显微镜观察，肉汤或琼脂斜面培养 生化分析：养分消耗速度，pH变化，溶解氧利用， 色泽， 气味等1 1、酶的生产菌种、酶的生产菌种 （一）培养基成分对产酶的影响 1. 碳源 淀粉及其水解物,可作为产酶诱导物 2. 氮源 无机氮和有机氮 3. 无机盐类 大量元素和微量元素 4. 生长因子 氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素、激素 5. 产

22、酶促进剂 表面活性剂、植酸钙镁、LS(脂肪酰胺磺 酸钠) 聚乙烯醇、EDTA等2 2、培养基和培养条件对产酶影响与调节、培养基和培养条件对产酶影响与调节 1. 1. pH对产酶的影响与调节控制对产酶的影响与调节控制 细菌、放线菌 中性至微碱性；霉菌、酵母菌：微酸性培养基pH的改变会影响产酶的种类和比例 调节控制 控制培养基的组分或比例；添加pH缓冲物种；流加酸碱溶液或补料；提高空气流量2 2、培养基和培养条件对产酶影响与调节、培养基和培养条件对产酶影响与调节 2. 2. 温度温度对产酶的影响与调节控制对产酶的影响与调节控制 不同的微生物生长与产酶的最适温度各不不同；很多微生物发酵产酶的最适温度

23、与生长繁殖的最适温度不同，且往往低于生长最适温度。 在酶发酵生产的不同阶段控制不同的温度条件，进行变温发酵。例如有报道，以枯草芽胞杆菌进行中性蛋白酶生产时，培养温度从31逐渐升温至40，然后再降温至31进行培养，蛋白酶产量比不升温时提高66。2 2、培养基和培养条件对产酶影响与调节、培养基和培养条件对产酶影响与调节 2. 2. 温度温度对产酶的影响与调节控制对产酶的影响与调节控制 调节控制 液态发酵可利用发酵罐的夹套、盘管或蛇管等通过温（冷）水进行调节控制，固态发酵可通过通风量或风温来进行调节。2 2、培养基和培养条件对产酶影响与调节、培养基和培养条件对产酶影响与调节温度调节装置温度调节装置

24、3. 溶解氧对产酶的影响与调节控制 临界氧浓度不影响细胞正常代谢的最低氧浓度溶氧浓度是溶氧浓度是由溶氧速率和耗氧速率来决定的。 调节控制 调节氧分压 改变进气压力或罐压，改变氧含量，添加氧载体 增加通气量 延长气液接触时间，增加气液接触面积 改变培养液的性质 改变组分或浓度，添加消泡剂2 2、培养基和培养条件对产酶影响与调节、培养基和培养条件对产酶影响与调节 4. 泡沫对产酶的影响与控制 泡沫的不利影响： 阻碍CO2的排除，影响O2的溶解； 发酵液溢出，造成原料浪费，引起杂菌污染； 发酵罐装料量受限，降低发酵罐的利用率； 控制泡沫的方法： 选育不易产生泡沫的菌种； 调节培养基中营养成分，减少或

25、缓加易起泡的原料； 机械消泡或化学消泡；化学消泡剂：天然油类，甘油聚 醚，泡敌（聚环氧丙烷环氧乙烷甘油）。勤加、少加较好2 2、培养基和培养条件对产酶影响与调节、培养基和培养条件对产酶影响与调节 5. 湿度对产酶的影响与控制 对固体发酵产酶而言，影响微生物的产酶量，也会影响产酶达到高峰的时间。 特定菌种，发酵过程的不同时期，对湿度要求不同。固态发酵产酶，前期湿度低，后期湿度高，有利于产酶。 配制培养基时，控制物料的含水量；控制鼓风量大小，或调节空气的湿度；喷洒水分2 2、培养基和培养条件对产酶影响与调节、培养基和培养条件对产酶影响与调节调节控制调节控制 按发酵基质状态分为：按发酵基质状态分为：

26、 （一）液体深层发酵3 3、发酵方法、发酵方法 优点：优点： 产酶纯度高，质量稳定；产酶纯度高，质量稳定； 较易控制发酵条件，易自动化较易控制发酵条件，易自动化 控制；控制； 机械化程度高，劳动强度小；机械化程度高，劳动强度小； 设备利用率高。设备利用率高。 缺点：缺点： 设备投资大设备投资大 按发酵基质状态分为：按发酵基质状态分为： （二）固体发酵 固体发酵方式：浅盘培养、转鼓培养、厚层通风培养、压力脉动固态发酵（新）3 3、发酵方法、发酵方法优点：优点： 设备简单，环境污染少；产酶率高；适合霉菌的培养。设备简单，环境污染少；产酶率高；适合霉菌的培养。缺点：缺点： 劳动强度大；原料利用率低；

27、产酶纯度差，劳动强度大；原料利用率低；产酶纯度差，提取精制提取精制困困难；传质传热效率低，发酵条件不易控制，产酶不稳定；不难；传质传热效率低，发酵条件不易控制，产酶不稳定；不能进行胞内酶的生产。能进行胞内酶的生产。3 3、发酵方法、发酵方法固体发酵固体发酵 按发酵基质状态分为：按发酵基质状态分为： 压力脉动固态发酵 压力脉动反应器的固体培养基是静态, 气相则是动态，且气体呈脉动式通入。 优点 实现了严格意义上的纯种培养，提高了产酶效率 实现发酵过程中的温度、湿度、pH值可控。 缺点 设备投资比传统固态发酵法高,但又比液体深层发酵低。3 3、发酵方法、发酵方法3 3、发酵方法、发酵方法压力脉动固态发酵压力脉动固态发酵 按物料交换情况分为以下几种： （三）分批发酵 特点：操作简单；发酵初期营养物过多可能抑制微生物的生长，中后期可能因为营养物的减少及有害代谢产物的积累而降低培养效率 （四）连续发酵 优点：可有效实现自动化，降低劳动强度，设备利用率高，可消除反馈阻遏作用，酶产率高。适合于与生长相偶联的发酵产物的生产。 缺点：易变异退化，易染杂菌。原料利用率低，生产成本增加。3 3、发酵方法