生化分离工程实验指导

1、生化分离工程实验指导菌株的优化培养菌株的优化培养总总DNA或或RNA的抽提的抽提PCR或或RT-PCR扩增目的基因扩增目的基因乙醇沉淀回收线性化片断乙醇沉淀回收线性化片断大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体pET-28酶连产物转化酶连产物转化 DH5 挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证及酶切验证)检索感兴趣的基因检索感兴趣的基因（katB为例）为例）直直接接优优化化并并合合成成连连T载测序载测序结构解析结构解析重组表达质粒转化重组表达质粒转化E.coli BL21(DE3)挑取重组子挑取重组子, 用菌落用菌落PCR方法验证方法验证IPTG诱导促使目的

2、大量蛋白表达诱导促使目的大量蛋白表达细胞破碎及蛋白抽提细胞破碎及蛋白抽提目标蛋白的纯化目标蛋白的纯化蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定-Bradford法法目标蛋白的鉴定目标蛋白的鉴定Western blotting结晶结晶本次试验内容本次试验内容lHis-Tag系统vpMAL系统katBfabZkatB是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的过氧化氢酶，其催化细胞内过氧化氢分解，保护细胞组织，防止膜脂过氧化。在菌体中常以四聚体的形式存在。大肠杆菌fabZ基因编码3-羟基脂酰ACP脱氢酶，是大肠杆菌脂肪酸代谢途径中的必须基因，该基因的突变会导致细菌细胞的死亡。背景资料背景资料目的基因目的基因 fab

3、Z基因：474bp；蛋白，酶切后MBP标签42.5kDa katB 基因：1467bp；蛋白背景资料背景资料表达载体表达载体vpMAL-c2系列的载体带有malE信号序列，能使融合蛋白穿过细胞膜。Imidazole（咪唑） 竞争关系背景资料背景资料组氨酸和组氨酸和Ni-NTA系统原理示意图系统原理示意图pMALMBP标签 SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子表面活性剂。它能打断蛋白质的氢键和疏水键，包裹蛋白，掩盖电荷差异和形状区别，使得电泳速率只与分子量有关。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (Acr) 和交联剂N，N亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，

4、并以此为支持物进行电泳。引发剂是过硫酸铵(APS)，催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）。背景资料背景资料聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)原理原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳，根据电荷差异和分子大小不同来分离蛋白质。浓缩效应浓缩效应和和分子筛效应分子筛效应注意事项：注意事项： 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用

5、。因此必须小心操作，不得吸入和接触皮肤，聚合完全聚丙烯酰胺凝胶无毒。电泳前确保玻璃杯下面的气泡去除干净！ 一一 、接种、接种系统系统His-Tag系统系统pMAL系统系统菌株编号B.t97-27JH022宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)大肠杆菌DH5目的基因katBfabZ培养基LB培养基LB培养基接种量2%（4ml）2%（4ml）加入抗生素Kan（200ul）Amp（200ul)按2%的接种量将两种菌株分别加入到含抗生素的LB培养基中,做好标记（写清组号、基因信息、抗性）。表达系统表达系统His-TagpMAL目的基因katBfabZ培养温度3737转速200 rpm200 rpm适宜状态O

6、D600=0.6OD600=0.5所需时间4 h4 h加入IPTG的终浓度0.2 mM(80 l)0.3 mM(120 l)二、诱导二、诱导注：在加入IPTG之前，摇匀菌液并各取1ml于1.5ml的离心管中，做好标记（组号，基因名）记作“诱导前”，放于离心管板中，于-20保存。配试剂将超净台内PA瓶中剩余的菌液用枪吸取200l于1.5ml离心管中，10000rpm离心1min，弃上清(可用枪将上清吸尽)。加入200l的无菌水洗涤菌体上残留的培养基，10000rpm离心1min，弃上清，然后重悬于40l灭过菌的去离子水中，100煮沸15min。10000rpm离心1min，取上清5l作为菌落PC

7、R的模板。三、菌液三、菌液PCR PCR （验证目的基因已转入宿主菌中（验证目的基因已转入宿主菌中）H2O8l10XPCRbuffer2.5ldNTP2.0l上游引物(F)1l下游引物(R)1lTaq酶0.5l模板5l总体积20llPCR体系lPCR程序955min9535s5530s7240s/90s7210min255minCycle 30注：阳性对照(将模板换成1 l质粒)； 阴性对照（将模板换成5 l H2O）； 不用重复，PCR管上做好标记！琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳1.制备0.8%琼脂糖凝胶(已配好)。2.胶板制备:将干净的胶板放入胶槽中，并在固定位置放好梳子。再将配好的琼脂糖凝

8、胶在微波炉里充分融化，冷却到65左右后小心地倒入胶槽内。室温静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子。将胶板放入电泳槽中，添加1TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2为止。3.加样:将PCR后的样品和与LoadingBuffer充分混匀后加入胶孔中。每加完一个样品，应更换一个枪头，以防污染。4.电泳:打开电源进行电泳（电压80V）。约30min后，停止电泳。5.电泳完毕后，取出凝胶用溴化乙锭（EB）染色。6.观察照相:在紫外灯下观察并用拍照保存。将加入诱导剂后的菌液再放入37，200rpm的摇床中诱导培养4-5小时后收集菌体。基因基因katBfabZ沉淀（离心管对应配平）8000rpm离心5min8000

9、rpm离心5min收菌弃上清，沉淀用15mlbindingbuffer重悬弃上清，沉淀用15mlcolumnbuffer重悬保存2020注：在离心沉淀之前摇匀菌液取1ml于的离心管中，做好标记（组 号，基因名）记作“诱导后” 放在第八组的离心管板上。离心时用天平严格配平（差异在0.02 g之内)！四、收菌四、收菌五、裂解细胞五、裂解细胞将冷冻保存的细胞团在室温下解冻，冰上破碎至菌液成澄清（200-300w超声610s-10s，约20min）,天平严格配平后10000*g，4，离心20min。上清取1ml于离心管中，作标记为“上清”沉淀用1ml对应的buffer（his-tag为bindingb

10、uffer，pMAL为columnbuffer）重悬后，保存在的离心管中，标记为“沉淀”。系统系统His-Tag系统系统pMAL系统系统柱子类型Ni-NTA柱直链淀粉柱充电（装满NISO4，温和摇动后自然沉降）操作方法3次bindingbuffer平衡3次columnbuffer平衡堵住下端后上样（10ml）静止5min，盛接流出液后再上样，重复两次上样（10ml）静止5min，盛接流出液后再上样，重复两次收集最后一次穿透液，取1ml于1.5ml离心管中，标记“穿透”收集最后一次穿透液，取1ml于1.5ml离心管中，标记“穿透”washbuffer水洗，直到用100%TCA检测没有白色沉淀为止

11、，一般45次3次Columnbuffer水洗，直到用100%TCA检测没有白色沉淀为止Elutionbuffer洗涤（每加1ml用1.5ml离心管收集)共收集7管Columnbuffer+10mM麦芽糖的溶液洗涤（每加1ml用1.5ml离心管收集)共收集7管六、蛋白纯化六、蛋白纯化系统系统His-Tag系统系统pMAL系统系统操作步骤Elutionbuffer洗涤2次buffer+10mM麦芽糖的溶液洗涤2次加入20%乙醇保存加入20%乙醇保存酶切去除标签注：收集到的蛋白做好标记后须在冰上保存，避免其失活pMAL系统系统MBP标签的切除标签的切除从A595最大的几管(一般是第二、第三管)取80

12、l用于蛋白酶FactorXa的酶解。在80l洗脱液中取15l保存在pcr管中，作为酶切对照。剩下的65l加入3l的FactorXa后混匀，室温下反应2h。分分别在、别在、1h、2h取样取样15 l。注：每次取样做好标记后，将样品放于-20保存第 1步：2倍体积 6M 盐酸胍，醋酸 第 2步：2倍体积水 第 3步：1倍体积 2% SDS（注意低温容易析出） 第 4步：1倍体积 25%乙醇 第 5步：1 倍体积 50%乙醇 第 6步：1 倍体积 75%乙醇 第 7步：5 倍体积 100%乙醇 第 8步：1倍体积 75%乙醇 第 9步：1倍体积 50%乙醇 第 10步：1倍体积 25%乙醇 第 11

13、步：1倍体积水 第 12步：5倍体积 100mM EDTA，pH8.0 第 13步：3倍体积水 由于 EDTA处理后仍可有少量蛋白未能完全释放，建议在纯化不同蛋白时应另换 HisBind 树脂。树脂的再生树脂的再生当柱流速明显下降，或树脂在使用离子化缓冲液处理之后没能显示深蓝绿色，则树脂需要更彻底的清洗处理。分离胶（分离胶（12%)浓缩胶浓缩胶(5%)ddH2O3.5 ml 2.33 ml 30%丙烯酰胺4 ml 0.67 ml 分离胶-buffer2.5 ml 不加浓缩胶-buffer不加1 ml 10%APS50 l30 l10%SDS50 l30 lTEMED10 l10 l总体积10

14、ml 4 ml 七、配制七、配制SDS-PAGESDS-PAGE注意：梳子厚度与胶板厚度要配套！注意：梳子厚度与胶板厚度要配套！ 八、八、SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳l点样顺序：诱前、诱后、沉淀、上清、穿透液、W1、W终、E1、E2、E3、酶切后l点样前：所有的样品点样前都要沸水浴15分钟使蛋白质完全变性。一般的点样量为10-20ul。(记录点样顺序记录点样顺序)l点样完毕后即可开始电泳，先以80伏电压跑15-20分钟，蛋白质通过积层胶后，更换到120伏，待溴酚蓝接近分离胶底部后停止电泳，取下胶板，小心撬开胶板割取分离胶，放入染色皿中，加入一定染色液（没过胶面即可）。置于摇床上染色3小时左右。l染色完毕后，回收染色液，加入脱色液，摇床脱色数次，最后一次可以过夜脱色。1、标准曲线的制作、标准曲线的制作（1）标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白（BSA)配置成 各浓度的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝G-250 溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用蒸 馏水稀释至1L。九、蛋白浓度测定九、蛋白