分离工程第七章

1、In 1903，俄国植物学家Michael Tsweetts Work(see Ber. Deut. Botan. Ges., 1906; 24: 384).Chromatography = (chromatus = color, graphein = to write).A、图形包含的意义、图形包含的意义B、分离机制、分离机制C、柱效、柱效D、分离度、分离度纸层析纸层析1、一般过程、一般过程2、分类、分类3 3、名词术语、名词术语4、理论、理论4.1、塔板理论、塔板理论4.2、速率理论、速率理论4.3、分离度、分离度4.4、定性分析、定性分析4.5、定量分析、定量分析4.6、定量方法定量方法

2、 5 应用应用: 违禁药违禁药物分析物分析丁卡因N-烯丙基原吗啡l层析：层析：根据混合物中，溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别，引起移动速度的不同而进行分离的方法。l原理：原理：互不相溶的两相分别称为固定相和流动相，固定相填充与柱中，在一端（入口）加入一定量的料液后，连续输入流动相，料液中的溶质在流动相和固定相之间发生扩散传质，产生分配平衡。l分配系数m大的溶质在固定相上存在的几率大，随流动相移动的速度小。这样，溶质之间由于移动速度的不同而得到分离，在层析柱出口处各个溶质的浓度变化如前图所示。组件及过程：组件及过程：A 色谱柱(column)：B 固定相(stationary phase)

3、：C 流动相(flow phase)：D 洗脱液(elution)：E 检测器(detector)：F部分收集器(portion collector)1)、按应用的目的、按应用的目的A、制备性色谱(preparation Chromatography)：工业规模，实验室规模B、分析性色谱(analytical Chromatography)：GC、LC、HPLC、TLC等。 2)、按流动相、按流动相A、GC:气-固色谱法(固定相为固体)气-液色谱法(将不挥发的液体固定在适当的固体载体上作为固定相)B 、LC 液-固色谱(固定相为固体)液-液色谱(液体固定相固定在适当的固体上) 3)、按色谱的展

4、开形式、按色谱的展开形式A、柱色谱法B、毛细管色谱法C、平板色谱法：硅胶板色谱、纸色谱4)、按展开程序、按展开程序A)、洗脱法洗脱法：料液中的溶质根据其在固定相和流动相中的分配行为的不同，在柱出口处被展开形成相互分离的色谱峰。B)、顶替法顶替法：与A相似，不同在于：采用的洗脱液中含有与固定相的亲和力比料液中各个组分都大的物质（称顶替剂），它将料液中所有溶质按其与固定相的亲和力的大小不同从柱中按次序出来。适于大量处理稀溶液。C)、迎头法迎头法：与一般的固定床吸附操作相同，大量料液连续输入到层析柱中，直到在出口处发生溶质穿透，只有最先穿透的（分配系数大OR小？）组分能以纯粹的状态得到部分回收，之后

5、的流出液均为双组分或多组分的混合物。最常见的是A，本章主要讨论的内容。国际通用色谱法分类及其缩写国际通用色谱法分类及其缩写 分配系数分配系数m：式中，cs和cm分别为组份在固定相和流动相中的浓度。m类型：类型：A、B型曲线是一条典型的吸附等温线，吸附色谱法属于这类曲线。C和D型吸附等温线很少遇到。C曲线为线性分配等温线。线性色谱：溶质浓度低时，m为常数时的色谱意义：意义：容易理解，溶质流过色谱柱时，m大的组份通过色谱柱所需要的时间长，m小的组份需要的时间短；当样品中各组份在两相的m不同时，就能实现差速迁移，达到分离的目的。msccm Why?色谱术语色谱术语 ：A、基线：、基线：B、峰高：、峰

6、高：色谱峰顶与基线间的垂直距离，以h表示。 C、保留值：、保留值：死时间死时间tm：不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间。因为物质不被固定相吸附，故其流动速度将与流动相的流动速度相近：保留时间保留时间tr：试样从进样到柱后出现峰极大点时所经历的时间。调整保留时间调整保留时间tr：.0,1umLtimitr的表达的表达：时间单位(如s, d, h), 距离单位(如cm)，体积(ml, l)表示。tr意义意义：色谱法定性的基本依据，但同一组份的tr常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定。D、死体积、死体积VM：指色谱柱内固定相颗粒间

7、所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和，当后两项很小而可忽略不计时， VM可由 tm与流动相体积流速F0(ml/min)计算：E、保留体积、保留体积VR：指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与tr的关系如下：F、调整保留体积、调整保留体积VR：某组份VR扣除VM后，称该组份的VR ，即G、相对保留值、相对保留值 2,1：某组份2与组份1的调整保留值之比，即：由于 2,1只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，如GC、HPLC中，广泛使用的定性数据。注意： 2,1绝不是两个组份保留时间

8、或保留体积之比在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标值(s), 然后再求其它峰(i)对这个峰的相对保留值。此时r,i 可能大于1，也可能小于1。在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数。在这种特殊情况下，可用符号a表示： 式中tr,2为下一峰的调整保留时间，所以这时a总是大于1。H)、分配比、分配比k, 即容量因子：即容量因子：意义意义：色谱柱对组份保留能力的重要参数k与m的关系：4)、区域宽度、区域宽度色谱主峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：A、标准差、标准差 ：0.607倍

9、峰高处峰宽的一半。B、半峰宽、半峰宽Y1/2：峰高一半处对应的峰宽。它与 的关系为C、基线宽度、基线宽度Y：色谱两侧拐点上的切线在基线上的截距。它与 的关系是msimmissiVVmVcVck,色谱曲线反映出的重要信息：色谱曲线反映出的重要信息：A、根据色谱峰的个数，可以断样品中所含组份的最少数；B、根据色谱峰的保留值(或位置)，可以进行定性分析；C、根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析；D、依据色谱峰的保留值及其区域宽度，评价色谱柱分离效能；E、色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据。两组份完全分离必须满足：两组份完全分离必须满足：A、两组份的分配系数必须有差异

10、；B、区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；C、在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。它不仅应说明组份在色谱柱中移动的速率，而且应说明组份在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提，故称为线性色谱理论线性色谱理论。速率理论对色谱分离条件的选择具有实际指导意义，因此本节将重点介绍 塔板模型塔板模型:将色谱柱视为精馏塔，即色谱柱是一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板高(plate high)为H。假设在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前转移。对一长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：n称为理论塔板

11、数(theoretical plate number)。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随塔板高H的增大而减小。n与半峰宽及峰底的关系式为与半峰宽及峰底的关系式为: 式中tr(或Y1/2)应采取同一单位(时间或距离)。上式示：在tR一定时，如果色谱峰越窄，则说明n越大，H越小，柱效能越高。在实际工作中，按上式计算出来的n和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用tR计算时，没有扣除死时间tM，所以，常用有效塔板数n有效表示柱效： 有效塔板高为： 例例1 已知某组分峰的峰底宽为40S，保留时间为400S，计算此色谱柱的理论塔板数。例例2 已知一根1米长的色谱柱的有

12、效塔板数为1600块，组份A在该柱上的调整保留时间为100秒，试求A峰的半峰宽及有效塔塔板高度。1956年，荷兰学者范姆特（van Deemter）等人在研究气液色谱时，提出了色谱过程的动力学理论速率理论。他们吸收了塔板理论中塔板高的概念，并同时考虑影响塔板高的动力学因素，指出：填充柱的柱效受分子扩散、传质阻力、载气流等因素的控制，从而较好地解释了影响塔板高的各种因素。谱峰扩宽受三个动力学因素的控制，即涡流扩散，分子扩散项，传质阻力项。这样, 上述塔板高方程表示式中，A、B、C为常数，分别代表分子扩散项系数、涡流扩散项系数和传质阻力项系数。由上式知，当一定，只有当A、B、C较小时，H才能小，柱

13、效才会高。反之则柱效低，色谱峰扩张。11302)(22mmDuduDHETPHepzuCBuAH柱效柱效n n 衡量柱效的指标是n(或neff)，柱效则反映了色谱分离过程的动力学性质。选择性选择性 为洗脱峰相临的两种溶质的容量因子之比.分离度分离度图是两相邻组份在不同色谱条件下的分离情况。a）中两组份没有完全分离。b）和c）中两组份完全分离，前者的柱效虽不高，但选择性好；后者的选择性较差，但柱效高。由此可见，单独用柱效或柱选择性并不能真实地反映组份在色谱柱中的分离情况，所以，在色谱分析中，需要引入分离度(RS)这一概念。12kk分离度也称分辨度。它是指相邻两色谱保留值之差与两峰底宽平均值之比，

14、即一般来说，当Rs 1.5时，两峰才能完全分离。当然，更大的Rs值，分度效果会更好，但会延长分析时间。利用上式，可以直接从色谱图上计算分离度。但该式没有体现影响分离度的诸因素。而下式清楚地指出了，分离度受柱效n、选择性x和容量因子k三个参数的控制：意义意义：第一，增加塔板数，可以增加分离度，若通过增加柱长来增加塔板数，就会延长分析时间。所以，设法降低塔板高H，才是增大分离度的最好方法。第二，加大容量因子可以增加分离度，但是会延长分析时间，至造成谱带检测困难。一般来说，当k 10时，分离度的提高并不明显；而当k 2时，即使在很短的时间内，组份也会完全分离。当 1时，要完成分离，必须增加柱长，延长

15、分析时间。例如，为了达到同样的分离度，当 = 1.01时，所需的时间是 = 1.1时的84倍。显然，当 = 1时，无论怎样提高柱效，加大容量因子等，Rs均为零。在这种情况下，两组份的分离是不可能的。制备性色谱定性分析制备性色谱定性分析特异性检测分析性色谱定性分析分析性色谱定性分析1st 在色谱条件一定时，任何一种物质都有确定的保留保留时间时间。2nd相对保留值相对保留值 2,1：.0,1umLtimi定量依据定量依据在一定色谱条件下，组份i的质量(mi) 或其在流动相中的浓度，与检测器响应讯号（峰面积Ai或峰高hi ）成正比：式中fiA和fih是绝对校正因子。峰高测量峰高测量峰面积测量峰面积测

16、量1st 自动测量：自动测量：2nd 手工测量：手工测量：手工测量的有关计算峰面积公式为对于对称的峰，近似计算公式为对于不对称的峰的近似计算公式为式中Y0.15和Y0.85 分别是峰高0.15和0.85处峰宽值.峰面积的大小不易受操作条件如柱温、流动相的流速、进样的速度等的影响，从这一点来看，峰面积更适于作为定量分析的参数。定量校正因子定量校正因子1st 绝对校正因子绝对校正因子组份峰面积和峰高的绝对校正因子分别为： 由此可见，绝对校正因子是指某组份通过检测器的量与检测器对该组份的响应信号之比。存在问题：存在问题：很明显，绝对校正因子受仪器及操作条件的影响很大，偶然误差和系统误差较多，故其应用

17、受到限制。解决之道：相对校正因子2nd 相对校正因子相对校正因子指组份i与基准组份s的绝对校正因子之比，即式中fAis和fhis分别为组份的峰面积和峰高相对校正因子，fAs和fhs分别为基准组份s的峰面积和峰高绝对校正因子。必须注意，相对校正因子因量纲(相当于同身寸尺)。绝对校正因子很少使用，一般文献上提到的是相对校正因子。优点：优点：相对校正因子消除了偶然误差和系统误差较.3rd 相对响应值相对响应值也叫相对应答值，即相对灵敏度，当计量单位相同时，它们与相对校正因子互为倒数：外标法外标法1st 作标准曲线：作标准曲线：将欲测组份的纯物质配制成不同浓度的标准溶液，使浓度与待测组份相近，然后取固

18、定量的上述溶液进行色谱分析，得到标准样品的对应色谱图，以峰高或峰面积对浓度作图。这些数据应是一个通过原点的直线。2nd 定量分析定量分析测定时，在完全相同的条件下，取制作标准曲线时同样量的试样分析，测得该试样的响应讯号后，从标准曲线即可查出其百分含量。3rd 优点优点操作简单，因而适于工厂控制分析和自动分析4th 存在问题存在问题结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。内标法内标法1st 方法：方法：A、测定相对校正因子、测定相对校正因子：已知样品 + 一定量标准物，然后进行色谱分析。根据被测物和内标物在色谱图上相应的峰面积(或峰高)测定相对校正因子。B、测定样品含量：、测定样品含

19、量：未知样品 +一定量内标物/基准物.2nd 优点优点内标法是通过测量内标物及欲测组份的峰面积的相对值来进行计算的，因而可以在一定程度上消除操作条件等的变化所引起的误差。3rd内标法的缺点：在试样中增加了一个内标物，这常常给分离造成一定的困难。4th内标法的条件内标法的条件A、内标物必须是待测试样中不存在的；B、内标峰应与试样中各组份的峰分开，并尽量接近欲分析的组份。样品准备1st 100mg hair washed by 0.3% Tween 20 aqeous solution.2nd hair was cut into small fragments incubated 12h in 2

20、 ml 0.25M HCl3rd the incubation mixture was neutralised by NaOH4th solution was extracted into organic phase of 63% heptane + 19% dichloro-methane + 18% dichloro-ethane.5th evaporated by a stream of a i r a n d t h e r e s i d u e resissolved in a suitable solvent. 2、按层析的分离机理分类 （1）排阻层析(exclusion chr

21、omatography) 利用凝胶层析介质(固定相)交联度的不同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法，称之为排阻层析。 （2）离子交换层析(ion exchange chromatography) 利用固定相球形介质表面活性基团经化学键合方法，将具有交换能力的离子基团在固定相上面，这些离子基团可以与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分离的方法，称之为离子交换层析。（3）吸附层析(absorption chromatography) 利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对不同溶质吸附能力的强弱而进行分离的一种方法，称之为吸附层析。 被分离组分在固定相和流动相中不断发生吸附