腹部术后疲劳综合征代谢调控网络与评估指标的探索表征及中药干预研究

1、腹部术后疲劳综合征代谢调控网络与评估指标的探索表征及中药干预研究摘要针对术后疲劳综合征(POFS)机制不清楚、缺少客观评估指标的问题，本项目在前期研究的基础上，将代谢组学技术与动物实验、临床患者研究相结合，采用“代谢指纹谱潜在标志物发现靶标代谢物的定量研究”的完整代谢组学研究模式，探索表征两种POFS大鼠模型的血清、尿液代谢调控网络的异常变化，初步确认与POFS相关的生物标志物，甄别关键生物标示物并建立定量表征方法，在临床患者中对其进行识别、验证，以期建立POFS量化、客观的评估指标；此外，将刺五加总苷加入到此实验动物研究中，交叉验证标示物的正确性，研究刺五加总苷给药组的代谢特征及其与POFS

2、生物标记物的相关性，探索刺五加总苷防治POFS的作用机理。本课题的开展，将在POFS的代谢调控网络与病理机制的揭示及中药防治POFS作用机制的研究方面做出有益探索，对于POFS的诊断、预防和治疗有着重要的意义，并为刺五加总苷的进一步合理开发应用提供重要的科学依据。立项依据术后疲劳综合征(postoperative fatigue syndrome，POFS)是外科手术后一种常见的并发症，是指手术恢复期及接受康复的过程中，患者出现的以乏力、失眠、注意力不集中、抑郁、焦虑等症状为主要表现的一组症候群。几乎所有的大手术病人术后均会发生POFS，仅发病程度和持续时间不同而己。它不仅严重阻碍了术后正常的

3、康复过程，降低患者术后的生活质量，而且给临床治疗和社会经济带来了重大负担，已经逐渐成为一项重要的康复医学课题。因此，对术后疲劳综合征进行深入的基础研究，探究术后疲劳综合征的生物学基础与病理机制，对于术后疲劳综合征的诊断、预防和治疗有着极其重要的意义。近年来国内外学者对术后疲劳综合征的生化相关因素、疲劳评估方法、动物模型的建立以及治疗等方面进行了积极探索，并取得了重要进展。在生化因素方面，研究发现术后疲劳患者体内血清游离色氨酸、去甲肾上腺素、丙氨酸、血清镁和生长激素等表现高水平，而血清转铁蛋白、血清锌等表现较低水平。近年来研究也表明术后疲劳与外周IL-6、IL-1、IL-10、INF-、TNF-

4、水平和中枢5-羟色胺密切相关。在临床评估方面，发展建立了视觉模拟尺度( Visual Analogue Scales, VAS)、简明心境量表( Brief Profile of Mood States, BPOMS)、Chalder疲劳量表( Fatigue Scale -14, FS-14 )、围手术期疲劳评测量表( Identity-ConsequenceFatigue Scale , ICFS )等量表问卷测验。在动物模型方面，目前研究建立了70%大鼠肝部分切除和70小肠切除吻合术建立的两种POFS大鼠动物模型。这些腹部术后疲劳综合征临床评估和病因生化研究的相关工作，为腹部术后疲劳综合

5、征的生物学基础的表征做出了有益的探索，也为进一步研究腹部术后疲劳综合征病因学机制奠定了重要的基础。但是目前的研究还存在以下几个问题：第一、现有的术后疲劳综合征的评估主要依靠问卷或量表测验，缺乏客观、特异、准确的判定标准，是术后疲劳综合征评估、预防和治疗深入研究的瓶颈；第二、现有术后疲劳综合征病因学的生化研究仅专注于某一种生物小分子或某一种细胞因子，研究内容相对单一，从而导致缺乏多层次、多视角术后疲劳综合征的生物学基础的系统表征。而众所周知，人体是一个多代谢途经多调控网络构成的有机整体，疲劳尤其是术后疲劳发生时并非仅由体内的某一种生物分子或细胞因子失调所导致，而是系统中的生化代谢网络发生了一系列

6、病理性改变的整体表现，抛开生物体系的系统复杂性去研究术后疲劳综合征的病理变化，往往只能解释某一局部的现象，无法揭示人体作为一个整体的有机变化规律，难以全面阐释腹部术后疲劳综合征相关的机体代谢紊乱，进而难以遴选出术后疲劳综合征相关的生物标志物；第三、现有的腹部术后疲劳综合征的研究往往只在某一腹部手术动物模型上各自进行，缺少多种腹部手术模型的相互验证，更缺少从实验动物模型到临床患者的验证，难以找到腹部术后疲劳综合征的特征生物学基础和应用于临床评估的量化指标。要解决上述瓶颈问题，应当把术后疲劳综合征的研究与现代生命科学的新理论和新技术结合起来，引入系统生物学的思路和方法，将动物实验与临床患者研究相结

7、合，探究术后疲劳综合征的代谢调控网络及临床评估的量化指标。随着人类基因组测序工作的完成，各种“组学”技术迅猛发展，现代医学越来越多地采用系统生物学方法对疾病和药物效应进行研究。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学后出现的一门新兴技术，是系统生物学的重要组成部分，也逐渐成为转化研究的重要手段。代谢组学关注的是各种代谢路径底物和产物的小分子代谢物，反映细胞或组织在外界刺激或是遗传修饰下代谢应答的变化。目前代谢组学已经为一些重大疾病的发生机制和早期诊断的特异性标志物筛选以及药物作用靶点等相关研究开辟了新的途经。随着技术的日益成熟，通过在血清、尿液、脑脊液、细胞裂解液和各种分泌物等生物样本中筛选疾病标志物

8、已经成为国际上相关领域研究的热点。这为我们术后疲劳综合征标志物的筛选和疲劳形成机制的研究提供了新的思路。前述的研究高密度表明术后疲劳综合征与生化代谢小分子代谢紊乱密切相关。本实验室近期研究也发现在术后疲劳综合征大鼠血清中色氨酸明显高于对照组，而亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸明显低于对照组，可见，采用代谢组学进行术后疲劳综合征整体研究具有突出的优势，有望阐释术后疲劳综合征的代谢调控网络，获得临床评估生物标志物。但目前，绝大多数潜在生物标志物还未能在临床得到应用，难以实现从实验室到临床的转化。究其原因，是目前仍然主要采用的“非靶向”代谢组学分析，存在灵敏度、动态范围、重复性等方面的不足，需要与“靶向”互

9、为补充，即一方面利用“非靶向”代谢指纹谱进行整体分析，从总体上把握整体轮廓及其代谢演化轨迹，寻找潜在生物标志物，另一方面对“非靶向”获得的关键代谢物进行聚焦，对靶标代谢物的定量表征，详细研究和精确刻画其时空变化规律。因此，研究者认为，采用“非靶向代谢指纹谱潜在标志物发现靶标代谢物的定量研究”才是一套完整的代谢组学研究模式。但目前的多数研究还停留在前两个步骤。近年来，一些临床研究者也将组学的重点放在了潜在靶标生物标志物的定量研究，加速其向临床的转化。如对前列腺癌的研究发现了肌氨酸是一个潜在的标志物，研究者对其进行了靶标代谢物的后续研究，他们发现在小鼠体内通过酶失活的方法抑制肌氨酸的生成后，前列腺

10、癌的恶性程度得到了改善，证明此潜在标志物的重要性，可以为临床所用。此项研究证明了代谢组学在临床疾病（临床综合征）研究上的重要作用，更说明“基于靶标代谢物定量研究”对实验室到临床转化的重要性。目前，大多数“非靶向代谢指纹谱潜在标志物发现靶标代谢物的定量”的代谢组学研究还欠缺药物干预部分的内容。利用药物干预的结果，可以进一步验证标志物的正确性，还可以从标示物提示的角度对一些复杂且机理不明确的药物进行机理研究，这将大大丰富“代谢指纹谱潜在标志物发现靶标代谢物的定量研究”的内容和意义。目前复杂药物如中药的作用机理研究已经由原来的间化学成分对单靶点，发展成“系统对系统”的作用研究。其中，代谢组学技术以其

11、整体分析的特点，成为中药作用机理研究的一个重要手段，并提出了中药的三维模式研究、整合系统生物学研究等中药机理研究的代表性成果，形成了目前较有效的中药代谢组学整体研究方式。而中医药对POFS有独特的认识，认为POFS属于“疲劳”、“虚劳”之范畴，中医药对POFS的预防和治疗具有一定的优势，近年来发现人参皂苷Rb1、姜黄素、刺蓝抗疲口服液、刺五加总苷都具有一定的疗效，然而对它们作用机制研究仍处于初级阶段。因此，研究者认为，在动物实验水平，将中药（具有预防或治疗术后疲劳综合征的中药）代谢组学研究应该与术后疲劳综合征代谢组学研究相结合，借鉴其研究结果，利用其寻找到的潜在标志物，从标志物提示方向有针对性

12、的进行防治术后疲劳综合征中药治疗机理的研究，促进中药新药的研发和临床应用。在前期研究中，申请者采用70%大鼠肝部分切除大鼠POFS动物模型，利用UPLC-Q-TOFMS代谢组学方法，对POFS大鼠血清的代谢物轮廓进行了系统的表征，并从标志物提示方面对刺五加总苷防治POFS的作用机制进行了初步的探讨，主要研究结果如下：j鼠尾悬挂试验及力竭游泳试验表明70%大鼠肝部分切除组相比30%大鼠肝部分切除组表现出明显的术后疲劳综合征症状，刺五加总苷干预70%大鼠肝部分切除组相比模型比有明显改善，在抗术后疲劳综合征有一定的疗效；k采集各组血清，利用UPLC-Q-TOFMS技术进行代谢组学分析，发现模型组中血

13、清中色氨酸、花生四烯酸、柠檬酸、丙氨酸、20-HETE、溶血卵磷脂等代谢物明显高于对照组，而亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、苹果酸明显低于对照组，表明术后疲劳综合征表现出三羧酸循环、色氨酸代谢、支链氨基酸代谢、脂肪酸代谢、磷脂等代谢紊乱，而刺五加总苷对多数指标多有一定的回调作用，表明其通过调节这些失衡的代谢途经而发挥抗术后疲劳综合征的作用。以上研究工作，为我们联合70小肠切除吻合术建立的大鼠POFS模型，对术后疲劳综合征相关的生物标志物筛选、共性生物学基础的系统表征和刺五加总苷作用机制的深入研究奠定良好的基础，也为在临床患者验证提供了基础的实验数据。因此，在前期研究的基础上，本项目将基于液

14、相色谱质谱（LC-MS）的代谢组学技术与动物实验、临床患者研究相结合，采用“代谢指纹谱潜在标志物发现靶标代谢物的定量研究”完整的代谢组学研究模式，探索表征"70%大鼠肝部分切除和70小肠切除吻合术"法建立的两种术后疲劳综合征动物模型的血清、尿液代谢调控网络的异常变化，初步确认与术后疲劳综合征相关的生物标志物群，并对关键靶标生物标示物建立定量表征方法，在临床患者中对标志物进行识别、验证，以期建立术后疲劳综合征量化、客观的评估指标；此外，将中药刺五加总苷加入到此实验动物研究层次中，交叉验证标示物的正确性，研究刺五加总苷给药组的代谢特征及其与术后疲劳综合征生物标记物群的相关性，探

15、索刺五加总苷防治术后疲劳综合征的作用机理。本课题的开展，将在术后疲劳综合征代谢调控网络与病理机制的揭示及中药干预术后疲劳综合征作用机制的研究方面做出有益探索，对于术后疲劳综合征的诊断、预防和治疗有着重要的意义，并为刺五加总苷的进一步合理开发应用提供重要的科学依据。参考文献（略）研究内容：（1） 动物模型术后疲劳综合征血清和尿液代谢产物变化：采70%大鼠肝部分切除和70小肠切除吻合术法建立的两种术后疲劳综合征大鼠模型，应用液相色谱质谱（LC-MS）技术分析血清和尿液中代谢产物的差异，初步确定两种模型共性的差异代谢物为术后疲劳综合征标志物；（2） 术后疲劳综合征代谢调控网络构建及关键生物标志物遴选

16、：通过查询KEGG代谢途经数据库获取筛选出的标示物的相关代谢途经，构建术后疲劳综合征代谢调控网络，阐释术后疲劳综合征的病理机制，遴选出关键的生物标志物；（3） 标志物在临床患者中的筛选与识别：利用高效液相色谱法（HPLC）建立靶标代谢物的定量分析方法，检测大手术后产生术后疲劳综合征患者、小手术后无术后疲劳综合征患者患者血清、尿液中的标志物，考察标志物在临床患者中的代谢规律，进而明确标志物的临床应用性；（4） 动物水平的刺五加总苷干预验证及作用机理的研究：观察刺五加总苷干预后多个指标的变化，对前述研究结果进行验证；应用代谢谱的整体分析和靶标代谢物聚焦分析研究刺五加总苷对术后疲劳综合征大鼠血清和尿

17、液代谢模式变化，揭示药物对代谢网络的调控作用，阐明刺五加总苷的作用机理。研究目标1阐释70%大鼠肝部分切除与70小肠切除吻合术建立的大鼠术后疲劳综合征的代谢特征，明确其代谢共性特征，建立术后疲劳综合征的代谢调控网络；2. 遴选术后疲劳综合征关键代谢物，通过临床患者验证，确定术后疲劳综合征标志物；3.从代谢网络调控水平阐释刺五加总苷干预术后疲劳综合征的机理拟解决的关键科学问题1. 稳定可靠的动物模型建立和评估是研究首先要解决的问题。2. 从代谢水平阐释术后疲劳的发病机制及中药抗术后疲劳综合征的代谢物变化是本研究的重点。3. 术后疲劳综合征评估关键代谢物的遴选是本研究的难点。技术路线实验方案可行性

18、分析（1） 立项依据充分，研究方法可行（2） 前期工作基础充分（3） 项目组具有很强的研究力量（4） 具有较好的硬件条件（5） 有良好的合作关系本项目的特色与创新之处术后疲劳综合征是现代康复医学研究与防治的重点问题，而术后疲劳综合征量化、客观的评估指标一直是困扰该领域的瓶颈，本研究在既往工作基础上采用新的研究思路与技术，首次采用“代谢指纹谱潜在标志物发现靶标代谢物的定量研究”完整的代谢组学研究模式从两种动物实验到临床患者水平，对术后疲劳综合征生物学基础及评估生物志进行筛选、识别，可望在术后疲劳综合征的评估指标的建立、术后疲劳综合征病理机制的阐明上获得突破性进展。同时，从代谢网络调控水平，对刺五

19、加总苷抗术后疲劳综合征的作用机制进行探讨，可以为中药疗效评价及机理研究提供良好的思路。年度研究计划（1） 2015.012015.12：动物实验，采用70%大鼠肝部分切除与70小肠切除吻合术建立大鼠术后疲劳综合征模型，采用液相色谱质谱（LC-MS）技术对各组大鼠的血清和尿液代谢物进行代谢谱数据采集，（2） 2016.012016.12：数据处理及机制分析，利用代谢组学数据分析软件对代谢谱进行分析，筛选鉴定术后疲劳综合征相关的代谢物，阐释术后疲劳综合征的调控网络，利用代谢富集分析，遴选术后疲劳综合征关键生物标志物，并从代谢网络调控水平，阐释刺五加总皂的干预术后疲劳综合征的机制；（3） 2017.

20、012017.12：临床研究，采用高效液相色谱（HPLC）方法在血中和尿液中检测筛选出的关键标志物，结合临床相关指标分析，进一步确认筛选、识别术后疲劳综合征评估指标；利用最后2-3个月时间进行项目总结、整理研究资料并撰写结题报告。预期研究成果（1） 从代谢物网络调控水平，阐释术后疲劳综合征生物学基础及其调控网络；（2） 筛选出术后疲劳综合征敏感、特异客观的评估指标，并阐释其在术后疲劳综合征形成的机制和作用；（3） 阐释刺五加苷干预术后疲劳综合征的作用机理及其调控网络；（4） 在国内核心期刊和国外相关杂志发表研究论文3-4篇，其中SCI收录论文2篇以上。（二）研究基础与工作条件1工作基础申请者采用70%大鼠肝部分切除大鼠POFS动物模型，利用UPLC-Q-TOFMS代谢组学方法，对POFS大鼠血清的代谢物轮