酶的提取与分离纯化

1、酶工程姜 静jing_QQ: 1336754154生物制药教研室(A511)12知识回顾知识回顾3 第四章第四章 酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化l预处理预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞：包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等。破碎（分离胞内产物）等。l初步纯化初步纯化（rough fractionation） （提取）：除（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质。去与目的产物性质差异很大的杂质。l高度纯化高度纯化（fine fractionation） （精制）：除（精制）：除去与产物性质相似的杂质。去与产物性质相似的杂质。l浓缩与干燥浓缩与干燥（concent

2、ration and desiccation）（成品加工）（成品加工）: :使酶与溶剂分离的过程。使酶与溶剂分离的过程。l纯化工艺评价纯化工艺评价 基因工程酶基因工程酶/蛋白分离纯化的一般流程蛋白分离纯化的一般流程6 第一节第一节 酶的分离酶的分离一、发酵液预处理一、发酵液预处理目的：目的：u 提高固液分离效率提高固液分离效率u 使产物转移用于后处理相中使产物转移用于后处理相中u 去除部分杂质去除部分杂质( (一一) )发酵液的相对纯化发酵液的相对纯化1. 1. 无机离子的去除无机离子的去除2. 2. 杂蛋白质的去除杂蛋白质的去除3. 3. 色素及其他物质的去除色素及其他物质的去除（降低离子强

3、度、酶活性影响）（降低离子强度、酶活性影响）（沉淀、变性、凝聚和絮凝、吸附）（沉淀、变性、凝聚和絮凝、吸附）7( (二）发酵液的固液分离二）发酵液的固液分离1 . 影响发酵液过滤的因素影响发酵液过滤的因素 l1）菌种）菌种l2）培养基组成）培养基组成2. 提高过滤性能的方法提高过滤性能的方法 1 1）絮凝和凝聚）絮凝和凝聚 2 2）稀释、加热）稀释、加热 3 3）加助滤剂，）加助滤剂，常用硅藻土等。常用硅藻土等。 8二、细胞破碎（二、细胞破碎（胞内酶胞内酶） （一）（一）细胞壁组成细胞壁组成 l细胞壁的主要成分：细胞壁的主要成分：l 细菌：肽聚糖细菌：肽聚糖(N-(N-乙酰萄糖胺，乙酰萄糖胺，

4、N-N-乙酰胞壁酸乙酰胞壁酸) )l 酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质l 真菌真菌: : 多糖（几丁质和葡聚糖）多糖（几丁质和葡聚糖） l 9各种微生物细胞壁的结构与组成各种微生物细胞壁的结构与组成 10 细菌细胞壁的结构细菌细胞壁的结构 酵母菌细胞壁的结构酵母菌细胞壁的结构 M甘露聚糖；甘露聚糖；P磷酸二酯键；磷酸二酯键；G葡聚糖葡聚糖 12（二）细胞破碎的方法（二）细胞破碎的方法 机械法机械法l机械捣碎法机械捣碎法l研磨破碎法研磨破碎法l匀浆破碎法匀浆破碎法l高压匀浆法高压匀浆法l超声破碎法超声破碎法非机械法非机械法l酶法酶法l化学法化学法l物理法物理法l干燥法

5、干燥法13l1.1.机械法：机械法：l 1 1）液体剪切：搅拌、匀浆。）液体剪切：搅拌、匀浆。l 2 2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。l 3 3）超声波破碎法。）超声波破碎法。l2. 2. 非机械法非机械法物理法物理法l 1 1）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等）l 平衡后迅速转入低渗溶液或水中。平衡后迅速转入低渗溶液或水中。l 2 2）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。14l3.3.酶解法（酶解法（e enzymatic lysisnzymatic lysis）： l 外加酶法：外加酶法：l 根据

6、细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。l 自溶法（自溶法（a autolysisutolysis）: :l 细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发 l生溶解的现象。生溶解的现象。15l4. 化学法化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变或破坏。使细胞膜结构改变或破坏。l 1 1）有机溶剂处理：）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用破坏膜磷脂结构，常用l丙酮、丁醇、氯仿等。丙酮、丁醇、氯仿等。l 2 2）表面活性剂处理：）表面活性剂处理：常用非离子型表面常用非离子型表面l活性剂

7、，如活性剂，如Triton X-100Triton X-100，TweenTween等。等。16破菌破菌 分离策略分离策略酶法酶法+高压匀浆高压匀浆/超声超声盐及表面活性剂盐及表面活性剂低浓度的变性剂低浓度的变性剂DetergentIntact membraneDetergentDetergent-solubilized proteinsa17（三）细胞破碎确认（三）细胞破碎确认 1.1.直接测定破碎前后的细胞数直接测定破碎前后的细胞数： 破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数； 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。破碎后，用染色法区分破碎细胞与

8、完整细胞。 2.2.测定导电率测定导电率： 利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 3.3.测定释放的蛋白质量或酶活力测定释放的蛋白质量或酶活力： 测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。估算破碎率。 18三、酶的提取三、酶的提取(extraction)(extraction) l 把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。质从原料中引入溶液。 l 19 提取目标：提取目标：

9、a. 将将目的酶最大限度地溶解出来。目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。保持生物活性。l注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，l一般一般采用低温下（采用低温下（0 0 1010）操作。操作。20提取原则提取原则la. 相似相溶。相似相溶。lb. 远离等电点的远离等电点的pH值，溶解度增加。值，溶解度增加。21 提取方法提取方法：（一）盐溶液提取（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用常用稀盐（常用NaClNaCl）溶液（盐溶），）溶液（盐溶），对酶稳定性好、溶解度大对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。，最常用。 （二）酸、碱溶液提取（二）酸、

10、碱溶液提取（三）有机溶剂提取（三）有机溶剂提取22四、四、 离心分离离心分离三种形式：三种形式：1 1）离心沉降）离心沉降2 2）离心过滤）离心过滤3 3）离心分离和超离心）离心分离和超离心 23（一）一）基本原理基本原理1. 1. 离心力离心力 Fc = m ac m r r 2 2 m r r （2 N/60）2 2 N为离心机为离心机每分钟转数每分钟转数 （r/min ）；）； Fc通常以相对离心力通常以相对离心力RCF（relative centrifugal force）表示，）表示，即离心力即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。）的多少

11、倍。一一般用般用g g（或数字（或数字 g g）表示。）表示。RCF = RCF = m r r （2 N/60）2 2 /mg= 1.12 = 1.12 1010-5 -5 N2 2 r 此公式描述了相对离心力与转速之间的关系此公式描述了相对离心力与转速之间的关系 旋转半径用旋转半径用r r平均平均代替代替 r r平均平均=1/2=1/2（r r大大+r+r小小）cmcm242. 沉降系数沉降系数:（sedimentation constant） 指单位离心力下颗粒的沉降速度指单位离心力下颗粒的沉降速度（sedimentation velocity）, ,用用S表示表示。 由于许多生物大分子

12、的由于许多生物大分子的S S值很小，所以定值很小，所以定义义10 10 13 s 为一个沉降单位，为一个沉降单位，1S = 1 10 13 s。 常用常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚表示某些生物大分子、亚细胞及亚细胞器的大小，如细胞器的大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系，蛋白质的沉降系数一般在数一般在1 200之间。之间。 25（二）离心机的种类（二）离心机的种类 按离心机转速的不同，分为：按离心机转速的不同，分为： 常速（低速）常速（低速） 高速高速 超速超速 26离心机的种类离心机的种类 27l温度类型：温度类型：常温及常温及冷冻冷冻l超速离心机均为冷超速离心机均为冷冻型。冻型。l使

13、用冷冻离心机时使用冷冻离心机时提前降温，预冷离提前降温，预冷离心头。心头。l使用超速离心机时使用超速离心机时先抽真空。先抽真空。28l角式及外摆式：外摆式一般为低速，角式及外摆式：外摆式一般为低速， l 角式由低速到超速均有。角式由低速到超速均有。 29l角式离心头要配套，低温使用要预冷，操角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。作注意稳、盖、旋紧。303132l材质：玻璃，材质：玻璃，塑料塑料l强度：和离强度：和离心速度相配心速度相配l大小：和转大小：和转子配套子配套l高速超速管高速超速管要加盖要加盖33l平衡、定温、定速、定时。平衡、定温、定速、定时。34（三）常用离心方法

14、（三）常用离心方法 差速离心法差速离心法 沉降速度法沉降速度法 密度梯度离心密度梯度离心 沉降平衡法沉降平衡法 等密度梯度离心等密度梯度离心351差速离心差速离心 （differential centrifugationdifferential centrifugation） 采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法度不同的颗粒分批分离的方法。特点：特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。用于分离大小和密度差异较大的颗粒。 优点：优点：操作简单操作简单 。缺点：缺点：1）分离效果较差，分离效果较差， 不能一次得到纯颗粒。不能一次得到

15、纯颗粒。 2）沉降的颗粒受到挤压沉降的颗粒受到挤压。36 差速离心分离示意图差速离心分离示意图 （a a）离心前的悬浮液）离心前的悬浮液 （b b）（）（e e）离心不同时间后颗粒的沉降情况）离心不同时间后颗粒的沉降情况 37382密度梯度离心密度梯度离心 （density gradient centrifugationdensity gradient centrifugation） 样品在样品在密度梯度介质密度梯度介质中进行离心，使沉中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。分离方法。 常用的密度梯度溶液是常用的密度梯度溶液是蔗糖蔗

16、糖溶液。溶液。39特点：特点：区带内的液相介质密度小于样品物质区带内的液相介质密度小于样品物质 颗粒的密度。颗粒的密度。适宜分离密度相近而大小不同的固相适宜分离密度相近而大小不同的固相 物质物质。40 密度梯度离心示意图密度梯度离心示意图 （a a）离心前）离心前 （b b）离心后）离心后 41Density gradient ultracentrifugation42 步骤：步骤： A.形成密度梯度形成密度梯度 B. 加样加样 C.离心离心 D.收集样品收集样品433. 等密度梯度离心等密度梯度离心 又称又称沉降平衡离心沉降平衡离心 （sedimentation sedimentation

17、equilibrium centrifugationequilibrium centrifugation）。）。 根据根据颗粒的密度不同颗粒的密度不同而进行分离。而进行分离。 离心时，在离心介质的密度梯度范围内，离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。区带。 44常用常用氯化铯氯化铯（CsClCsCl）作为梯度介质。）作为梯度介质。特点：特点： 介质的密度梯度范围包括所有待分离介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。物质的密度。适于分离沉

18、降系数相近，但密度不同适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。的物质。45 等密度梯度离心示意图等密度梯度离心示意图 （a a）离心前；）离心前； （b b）离心后）离心后 46沉降速度离心和沉降平衡离心的特点沉降速度离心和沉降平衡离心的特点4748（四）离心条件（四）离心条件离心力离心力: RCF = 1.12 RCF = 1.12 1010-5 -5 N2 2 r 离心时间离心时间: t=K/S*(最高立离心速度最高立离心速度/所需离心速度所需离心速度)2K=(lnr2-lnr1)/2= =(lnr2-lnr1)2.351011/n2温度和温度和pH:49五、沉淀分离（根据溶解度的不同）五

19、、沉淀分离（根据溶解度的不同）使溶液中的溶质由液相转变为固相析出使溶液中的溶质由液相转变为固相析出古老、实用、简单的初步分离方法古老、实用、简单的初步分离方法50l在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：l 中性盐沉淀（盐析法）中性盐沉淀（盐析法）l 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀l 选择性沉淀（热变性和酸碱变性）选择性沉淀（热变性和酸碱变性）l 等电点沉淀等电点沉淀l 有机聚合物沉淀有机聚合物沉淀51（一）盐析沉淀法（改变离子强度）（一）盐析沉淀法（改变离子强度） 1. 基本原理（盐溶和盐析）基本原理（盐溶和盐析） 向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可向蛋白

20、质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：产生两种现象： 1) 盐溶盐溶（salting insalting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析盐析（salting outsalting out） ： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。52硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响离子强度离子强度53 原因：原因： 高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。而沉淀。 不同

21、蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。蛋白质先后析出，称分段盐析。54蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域 555657l1）中性盐的选择）中性盐的选择l 常用（常用（NH4）2SO4，其突出优点：，其突出优点：l a. 溶解度大溶解度大l b. 分离效果好分离效果好l c. 不易引起变性不易引起变性l d. 价格便宜价格便宜l2. 盐析用盐盐析用盐582) 盐浓度的表示盐浓度的表示 用饱和（溶解）度表示用饱和（溶解）度表示: 溶液中

22、饱和硫酸铵的体积溶液中饱和硫酸铵的体积 饱和度饱和度 溶液的总体积溶液的总体积593) 调整盐浓度的方式调整盐浓度的方式 a. 饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。度又不太高时。 配制饱和硫酸铵溶液配制饱和硫酸铵溶液60所需添加饱和硫酸铵的体积可按下式计算：所需添加饱和硫酸铵的体积可按下式计算： S2-S1 V=V0 1-S2式中式中 V,V0分别为所需加入的饱和硫酸铵分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积体积及原溶液体积S2,S1分别为所需达到的硫酸铵饱和度和分别

23、为所需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度原来溶液的硫酸铵饱和度61b. 添加固体硫酸铵添加固体硫酸铵适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。达到的盐浓度又很高时。按下式计算，得表中数据按下式计算，得表中数据 B(S2-S1)W= 1-AS2A,B常数，与温度有关。常数，与温度有关。 实际使用时，可直接查表实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下（各种饱和度下需加固体硫酸铵的量）。需加固体硫酸铵的量）。62调整硫酸铵溶液饱和度计算调整硫酸铵溶液饱和度计算表表63l低饱和度：低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般饱和溶液

24、滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过终饱和度不超过4040。l高饱和度：高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。l1 1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。l2 2）冰箱中（）冰箱中（4 4）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。l3 3）沉淀再溶解后可用超滤）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltrationultrafiltration） 、透、透析析（dialysisdialysis）或层析或层析（chromatographychromatography）方法脱

25、盐。方法脱盐。64 3. 盐析曲线的制作盐析曲线的制作 l 如要分离一种新的蛋白质和酶，应先确定沉淀该如要分离一种新的蛋白质和酶，应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。物质的硫酸铵饱和度。 蛋白质量蛋白质量(mg)或酶活力或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵硫铵 饱和度饱和度 65 硫酸铵浓度（硫酸铵浓度（% %） 枯草杆菌枯草杆菌 - -淀粉酶发酵液的盐析曲线淀粉酶发酵液的盐析曲线 66l4. 盐析的影响因素盐析的影响因素l1) 离子强度和种类（介绍盐析常数）离子强度和种类（介绍盐析常数） 蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：I

26、KSSs0loglogI I：离子强度，：离子强度，I = MZI = MZ2 2；M M：离子浓度（：离子浓度（mol/Lmol/L）；）； Z Z：离子价数：离子价数S S：离子强度为：离子强度为I I时的蛋白质的溶解度（时的蛋白质的溶解度（g/Lg/L）S S0 0：离子强度为：离子强度为0 0时蛋白质的溶解度（时蛋白质的溶解度（g/Lg/L）KsKs：盐析常数，是与：盐析常数，是与蛋白质蛋白质和和盐种类盐种类有关的特性常数。有关的特性常数。 Ks Ks代表盐析效率代表盐析效率 ，其含义是随着盐浓度的增加，其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，蛋白质溶解度降低的速度，K Ks

27、 s越大盐析效果越好。越大盐析效果越好。 67 当温度一定时，当温度一定时，S S0 0对于某一溶质是常数，对于某一溶质是常数，用用表示，盐析方程式可改写为：表示，盐析方程式可改写为： log S = - Klog S = - Ks s I I 两种盐析法：两种盐析法：Ks分级盐析法分级盐析法 ：在一定的在一定的pH和温度条件下，和温度条件下，利用不同蛋白质利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变度或盐浓度（即改变I值）的沉淀方法。值）的沉淀方法。分级盐析法分级盐析法 ：在一定离子强度下，通过改在一定离子强度下，通过改变溶液的变溶液的pH及温度的沉淀方法

28、及温度的沉淀方法。6869l2) 蛋白质浓度：蛋白质浓度：l 过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，2.5%-3%2.5%-3%最好。最好。 l3) pH值：值：等电点处最易沉淀。等电点处最易沉淀。l4) 温度的影响：温度的影响：l稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。l浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。l 一般可在室温下进行。某些对温度敏感的一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在酶，可在04下操作下操作。70（二）（二） 有机溶剂沉淀（降低介电常数）有机溶剂沉淀（降低介电常数）l

29、利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。使之分离的方法。l1. 沉淀机理沉淀机理l 降低溶液的介电常数降低溶液的介电常数l 部分地引起蛋白质脱水部分地引起蛋白质脱水l2. 常用有机溶剂常用有机溶剂l 丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇，用量一般为酶液体积的甲醇，用量一般为酶液体积的2 2倍倍左右，终浓度为左右，终浓度为70%70%。 71l3.优缺点：优缺点：l 优点优点：1）分辨率比盐析法高分辨率比盐析法高l 2） 沉淀不需脱盐沉淀不需脱盐l 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心）溶剂易蒸发，沉淀易离心l缺点：缺点：1）容易引起蛋白质变性失活）容易引起蛋白

30、质变性失活l2)2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。 l 72l4. 影响有机溶剂沉淀的因素影响有机溶剂沉淀的因素（1 1）温度）温度 ：低温（低温（0 0）操作。）操作。（2 2）pH pH 值：值：尽可能靠近其等电点。尽可能靠近其等电点。 （3 3）离子强度：）离子强度：采用采用 0.05mol/L0.05mol/L的稀盐溶液的稀盐溶液 增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度 目的目的 防止蛋白质变性防止蛋白质变性 （4 4）蛋白质浓度：）蛋白质浓度：适当，一般为适当，一般为5 52020mg/ml mg/ml 73（三）（三）

31、 等电点沉淀等电点沉淀(isoelectric precipitation)(isoelectric precipitation) l1.原理原理l 蛋白质在等电点时溶解度最低蛋白质在等电点时溶解度最低l 不同的蛋白质具有不同的等电点不同的蛋白质具有不同的等电点 l2. 使用方法使用方法l 单独单独使用使用较少（较少（用于从粗酶液中除去某些等电用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白）点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用，多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质蛋白质在等电点时在等电点时仍有一定的溶解度。仍有一定的溶解度。74l3. 优点：优

32、点：l 1）大多数蛋白质的大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内都在偏酸性范围内l 2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低l 3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化l4. 缺点：缺点：l 酸化时，容易引起蛋白质失活酸化时，容易引起蛋白质失活l 75（四）有机聚合物沉淀法（四）有机聚合物沉淀法 1. 作用机理：作用机理： 与有机溶剂类似与有机溶剂类似 ，是发展较快的一种新方法。，是发展较快的一种新方法。2. 沉淀剂：沉淀剂：常用常用聚乙二醇聚乙二醇 （Polyethyene glycol，简写，简写 PEGPEG ） 多用分子量

33、为多用分子量为600020000的的 PEG。3. 优点：优点：l操作条件温和，不易引起生物大分子变性。操作条件温和，不易引起生物大分子变性。l沉淀效能高，使用少量的沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当即可沉淀相当 l 多的生物大分子。多的生物大分子。l沉淀后有机聚合物容易去除。沉淀后有机聚合物容易去除。76l（五）选择性变性沉淀法（五）选择性变性沉淀法l 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。 l 热变性热变性l 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，几乎所有的蛋白质都因加热变性而

34、凝固，加热升加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。l pH变性变性l 等电点沉淀法是等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。变性法中的一种变体。l 有机溶剂变性有机溶剂变性l 使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。77六、萃取（六、萃取（extraction）分离）分离 利用溶质在互不相溶的两相之间分利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。的方法。l特点：特点：l1）比化学沉淀法分离程度高）比化学沉淀法分离程度高l2）比离子交换法选择性好

35、、传质快）比离子交换法选择性好、传质快l3）比蒸馏法能耗低）比蒸馏法能耗低 78（一）溶剂萃取法（一）溶剂萃取法 明确几个概念：明确几个概念：料液：料液：供提取的溶液。供提取的溶液。 溶质：溶质：料液中欲提取的物质料液中欲提取的物质 。萃取剂萃取剂 ：用来进行萃取的溶剂，通常是有机溶剂用来进行萃取的溶剂，通常是有机溶剂 。萃取液萃取液 ：经接触分离后，溶质转移到萃取剂中与经接触分离后，溶质转移到萃取剂中与 萃取剂形成的溶液萃取剂形成的溶液 。萃余液：萃余液：被萃取出溶质后的料液被萃取出溶质后的料液 。反萃取（反萃取（back extractionback extraction）：）：完成萃取操

36、作后，完成萃取操作后， 将产物从有机相转入水相的萃取操作。将产物从有机相转入水相的萃取操作。 79l溶剂萃取法是以分配定律（即溶质的分配平溶剂萃取法是以分配定律（即溶质的分配平衡规律衡规律 ）为基础。）为基础。l 在一定温度、压力下，溶质分布在两个在一定温度、压力下，溶质分布在两个互不相溶的溶剂里，达到平衡后，溶质在两互不相溶的溶剂里，达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数。相中的浓度比为一常数。l 萃取相浓度萃取相浓度 C1l分配系数分配系数 K K0 0 = = l 萃余相浓度萃余相浓度 C2l K K0 0值随溶液值随溶液pHpH的变化甚大，这是用萃取的变化甚大，这是用萃取法实现溶质提

37、取的重要基础。法实现溶质提取的重要基础。80l 普通有机溶剂萃取难以进行蛋白质的分离，普通有机溶剂萃取难以进行蛋白质的分离， l 因为因为:l1） 蛋白质亲水性，不溶于有机溶剂蛋白质亲水性，不溶于有机溶剂l2） 蛋白质在有机相中易变性失活蛋白质在有机相中易变性失活 故溶剂萃取法一般仅用于抗生素等小故溶剂萃取法一般仅用于抗生素等小分子生物物质的提取。分子生物物质的提取。 81萃取操作的萃取操作的3 3个步骤：个步骤： 1）混合）混合 2）分离）分离 3）溶剂回收）溶剂回收82（二）（二） 双水相萃取技术双水相萃取技术l 又称水溶液两相分配技术又称水溶液两相分配技术l（partion of two

38、 aqueous phase systempartion of two aqueous phase system） l 用两种不相溶的亲水性高分子聚用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（合物水溶液，如聚乙二醇（PEGPEG）和葡）和葡聚糖（聚糖（DextranDextran）进行萃取。由于形成）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达的两相均有很高的含水量（达70%70%90%90%），故称），故称“双水相双水相”系统。系统。 83l优点：优点：l1 1）每一水相中均有很高的含水量，为每一水相中均有很高的含水量，为 l酶等生物物质提供了一个良好的环境；酶等生物物质提供了一个良

39、好的环境；l2 2）PEGPEG、DextranDextran和无机盐对酶等无毒和无机盐对酶等无毒l害作用，不会引起变性。害作用，不会引起变性。 84 双水相的形成：双水相的形成： 两种不同水溶性聚合物浓度达到两种不同水溶性聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相一定值时，体系会自然地分成互不相容的两相，构成双水相体系。容的两相，构成双水相体系。 8586l 几种典型的双水相系统几种典型的双水相系统l聚丙二醇聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇聚乙二醇、聚乙烯醇l 葡聚糖（葡聚糖（Dex）l 羟丙基葡聚糖羟丙基葡聚糖l聚乙二醇（聚乙二醇（ PEG） 葡聚糖（葡聚糖（Dex）l硫酸葡聚糖钠盐硫酸葡

40、聚糖钠盐 聚丙烯乙二醇聚丙烯乙二醇l羧基甲基葡聚糖钠盐羧基甲基葡聚糖钠盐 甲基纤维素甲基纤维素l聚乙二醇（聚乙二醇（ PEG） 磷酸钾、磷酸钾、硫酸铵硫酸铵l 硫酸钠、硫酸镁硫酸钠、硫酸镁872. 萃取原理：萃取原理： 利用生物物质在双水相体系中的利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。选择性分配。88l3. 应用应用l 胞内酶的提取和精制胞内酶的提取和精制: l 除去细胞碎片，并使酶得到纯化。除去细胞碎片，并使酶得到纯化。l 89l 几种典型的双水相萃取酶蛋白实例几种典型的双水相萃取酶蛋白实例 酶酶 菌菌 种种 相系统相系统l延胡索酸酶延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG

41、/ 盐盐l天冬氨酸酶天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 盐盐l -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 盐盐l亮氨酸脱氢酶亮氨酸脱氢酶 Bacillus sp. PEG/Dexl乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶 Bakers yeast PEG/ 盐盐l青霉素酰化酶青霉素酰化酶 E. coli PEG/ 盐盐90 双水相萃取法的重要研究方向双水相萃取法的重要研究方向 亲和萃取（亲和分配亲和萃取（亲和分配 ） 使用具有生物特异性的配基（使用具有生物特异性的配基（ligandligand）来提高分离选择性。来提高分离选择性。 91亲和萃取酶实例亲和萃取酶实例蛋白质蛋白质配基配基胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋

42、白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶三嗪染料三嗪染料甲酸脱氢酶甲酸脱氢酶三嗪染料三嗪染料葡糖葡糖-6-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶三嗪染料三嗪染料92l（三）（三） 超临界流体萃取超临界流体萃取l 兼有蒸馏和溶液萃取的特征，兼有蒸馏和溶液萃取的特征，与常与常规溶剂萃取的区别：将超临界流体作为规溶剂萃取的区别：将超临界流体作为萃取剂。萃取剂。 l 超临界流体超临界流体(supercritical fluid(supercritical fluid，SCFSCF）：超过气液共存时的最高压力和：超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点最高温度下物质特有的点临界点后临界点后的流体的流体

43、。93（四）（四） 反胶团萃取反胶团萃取l1. 反胶团：反胶团：又称反胶束（又称反胶束（Reversed Micelles）l 指指表面活性剂表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续性基团两部分组成）分散在连续有机有机 溶剂溶剂中自发形成中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体的一种稳定的纳米级的聚集体。 反胶团模型反胶团模型亲水基团向内聚集亲水基团向内聚集9495 2. 萃取过程萃取过程第一步：第一步：将酶从水相中萃取到反胶束相中。将酶从水相中萃取到反胶束相中。第二步：第二步：将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相

44、 中，实现对蛋白质的反萃取过程。中，实现对蛋白质的反萃取过程。96 反胶团萃取原理反胶团萃取原理 97 3. 表面活性剂及有机溶剂表面活性剂及有机溶剂l 反胶团萃取与溶剂萃取的不同，是反胶团萃取与溶剂萃取的不同，是在有机溶剂中加入了少量表面活性剂。在有机溶剂中加入了少量表面活性剂。98l（1）表面活性剂）表面活性剂l 常用：常用： AOT(Aerosol OT)（阴离子表面活（阴离子表面活性剂，琥珀酸性剂，琥珀酸2-乙基己基酯磺酸钠）。乙基己基酯磺酸钠）。l特点：特点：易获得，强度好；极性基团小，形成的易获得，强度好；极性基团小，形成的反胶团空间较大，有利于蛋白质等生物大分子反胶团空间较大，有

45、利于蛋白质等生物大分子进入。进入。 l（2） 非极性有机溶剂非极性有机溶剂 环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油。环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油。 99l4. 优点优点l1）萃取率和反萃取率高。）萃取率和反萃取率高。l2）分离浓缩同时进行，溶剂可反复利用。）分离浓缩同时进行，溶剂可反复利用。l3 3）解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题。解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题。l4）破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白。）破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白。l5）成本低。）成本低。100离心离心沉沉淀淀粗纯化粗纯化精纯化（制）精纯化（制）上上清清分离分离101第二节 酶的精制（精纯化）l

46、纯化原理（掌握）l基本原则（掌握）l纯化技术（掌握原理、选择依据）102u纯化方法依据原理： 溶解度、特异性吸附、电荷、分子大小u酶纯化的基本原则：建立一个方便灵敏的分析方法(纯度、收率)；选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化步骤；选择适宜温度，保持酶活性以避免酶的变性；抗氧化失活（DTT, BME, EDTA, etc） ；其他添加剂，防止酶失活。第二节 酶的精制（精纯化）103u 酶精纯化常用技术l膜分离技术l柱层析技术l蛋白质结晶透析超滤凝胶过滤（分子筛/排阻）层析离子交换层析疏水层析吸附层析亲和层析反相层析104一、膜分离一、膜分离 借助一定孔径的高分子薄膜，将借助一定孔径的高分子薄膜，

47、将不同大小、形状、性质的颗粒或分子不同大小、形状、性质的颗粒或分子进行分离的技术。进行分离的技术。105膜分离技术的分类扩散膜分离扩散膜分离106（一）扩散膜分离（一）扩散膜分离 透析透析（dialysis）溶质分子溶质分子Y 从高浓度一侧通过膜向低浓度一侧移动从高浓度一侧通过膜向低浓度一侧移动107 1. 透析膜透析膜1 1）特点：）特点：多孔薄膜，允许小分子通过，阻止大分子通过；多孔薄膜，允许小分子通过，阻止大分子通过；化学惰性，多种溶液中不溶解；（化学惰性，多种溶液中不溶解；（材料：纤维素材料：纤维素衍生物衍生物）一定的机械强度；一定的机械强度；2）透析膜规格选择（表）透析膜规格选择（表

48、4.11-4.12）1082）透析膜的预处理：目的：除杂质。 3）透析袋的保存 ：防腐剂冷藏。109蛋白质透析蛋白质透析1102. 透析方法及装置透析方法及装置 透析袋透析简单装置。透析袋透析简单装置。A:A:透析夹，透析夹，B:B:透析，透析，C:C:透析示意图透析示意图 1113. 透析速度影响因素透析速度影响因素P164v浓度梯度v分子大小和形状v温 度v膜表面积v膜厚度112（二） 超滤 依据被分离物质分子大小、形状和性质的不同，在外力作用下形成一定压力差，使溶液中物质在超滤膜表面发生分离，从而达到分离、提纯和浓缩产品的目的。1131. 超滤膜特点l非对称双膜结构，包括分离层和支撑层。

49、l超滤膜性能指标包括渗透通量和截留率。1142. 超滤装置实验室装置115根据所截留物质颗粒大小的不同，分为根据所截留物质颗粒大小的不同，分为：116微滤微滤( (MicrofiltrationMicrofiltration，MF)MF) 一种静态过滤，随过一种静态过滤，随过滤时间延长，膜面上截流滤时间延长，膜面上截流沉积不溶物，引起水流阻沉积不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞；直至微孔全被堵塞；无 流 动 操 作渗 透 液原 料 液117常规过滤常规过滤(A)(A)和超滤和超滤(B)(B)的示意图的示意图 A AB1181192. 超滤装置工业装置

50、l中空纤维系统120l超滤膜包装置2. 超滤装置工业装置1213. 超滤膜的选择及使用l截留分子量l流速l材质l膜完整性l清洗与保存4. 影响流速的因素u溶质分子性质u溶质浓度u压 力u搅 拌u温 度u其 他122色谱起源色谱起源色谱色谱组分组分色素色素石油醚石油醚碳酸钙颗粒碳酸钙颗粒 用色彩（用色彩（chromachroma）和图谱（）和图谱（graphsgraphs）组）组成色谱一词（成色谱一词（Chromatography) Chromatography) 。123Column Chromatography124 层析柱的制备与层析操作层析柱的制备与层析操作 柱层析的设备柱层析的设备:

51、层析柱、蠕动泵（恒流泵）、检测仪、层析柱、蠕动泵（恒流泵）、检测仪、部分收集器、梯度洗脱器。部分收集器、梯度洗脱器。125l层析装置：层析装置：l 梯度混和器梯度混和器l 蠕动泵蠕动泵l 层析柱层析柱l 监测仪监测仪l 记录仪记录仪l 收集器收集器 126127128129现代化层析设备AKTA层析柱XKBPG130现代化层析设备AKTA131记录系统132良好的线性放大133134（1）. 基本原理基本原理 大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；的空隙向下移动，并最先被洗脱出来； 小分子物质可自由出入凝胶孔，流程

52、长而后流出小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。层析柱。135136137Size-exclusion chromatography138凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数KdKd表示：表示： Ve-Vo Kd= ViVo外水体积外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（的体积（ml）Vi内水体积内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（孔体积的总和（ml）Ve某组分的洗脱体积某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（出液中该组分出现高峰时的洗脱液体

53、积（ml）139凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰. K. Kd d=0=0时时, ,即即Ve=Vo,Ve=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。先流出。. K. Kd d=1=1时时, ,即即Ve=Vo+ViVe=Vo+Vi，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。最后流出。. . 其它组分其它组分0K0Kd d1,1,因分子大小而改变洗脱峰的位置。因分子大小而改变洗脱峰的位置。KdKd小的先小的先流出，流出，KdKd大的后流出。大的后流出。140 分配系数分配系数Kd的意义：的意义：

54、1) 可定量地衡量各组分的流出顺序。可定量地衡量各组分的流出顺序。2) 判断分离效果，判断分离效果，Kd差异大，分离效果好，差异大，分离效果好， Kd差异小，分离效果差。差异小，分离效果差。141（2 2）. .凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质 1)1)交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（dextran gel)dextran gel) 商品名商品名:Sephadex:Sephadex 型号型号 Sephadex GSephadex G1010至至G-200 G-200 G G 后的数字为凝胶吸水值的后的数字为凝胶吸水值的1010倍。倍。数字越大，交联度越小，孔径越大，分数字越大，交联度越小，孔径

55、越大，分离范围越广。离范围越广。142 葡聚糖凝胶层析介质的有关参数葡聚糖凝胶层析介质的有关参数 1432 2）琼脂糖凝胶（）琼脂糖凝胶（agarose gel)agarose gel) 商品名商品名:Sepharose :Sepharose （瑞典）（瑞典）; ; Bio-Gel A ( Bio-Gel A (美国）美国） 依靠糖链之间的次级键维持网状依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。密集。1443 3）聚丙烯酰胺凝胶）聚丙烯酰胺凝胶 （polyacrylamide gelpolyacrylamide gel） 商品名为商品名为

56、Bio-Gel,Bio-Gel,型号从型号从 Bio-Gel P Bio-Gel P2 2至至P-300P-300，P P值越大，孔径也越大。值越大，孔径也越大。 以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。145146（3） 操作：操作：1）凝胶的选择和处理）凝胶的选择和处理 根据相对分子质量范围选择相应型号的根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。凝胶介质。 将干胶悬浮于将干胶悬浮于510倍的倍的蒸馏水中蒸馏水中 ，充分，充分溶胀，抽气，装柱。溶胀，抽气，装柱。2）柱的选择）柱的选择 采用采用L/D比值

57、高的柱子，可提高分辨率，比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速但影响流速。147l3）加样）加样l 体积不能过多，不超过床体积的体积不能过多，不超过床体积的5，脱盐时，脱盐时可在可在10左右。左右。l4）洗脱）洗脱l 洗脱液与平衡时用的洗脱液与平衡时用的buffer一致。一致。l 洗速不可过快，保持恒速。洗速不可过快，保持恒速。l5）胶的保存）胶的保存l 洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。不必再生处理。l 用用0.02%NaN3防腐。防腐。1481494. 应用应用 1）脱盐）脱盐) 生物大分子物质的生物大分子物质的分离纯化分离纯化

58、3）分子量的测定）分子量的测定 4）溶液浓缩）溶液浓缩 150（二）离子交换层析（二）离子交换层析 （ion exchange chromatography，IEC）1512.离子交换剂离子交换剂： 离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。 纤维素纤维素 琼脂糖琼脂糖 葡聚糖葡聚糖 载体载体 电荷基团电荷基团 O OCHCH2 2COOCOO- -NaNa+ +反离子反离子1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。152离子交换剂离子交换剂-带有电荷基团的带有电荷基团的不溶性不溶性载体载体-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-

59、载体载体Diethylaminoethyl(DEAE) 阴离子交换剂阴离子交换剂(可吸附可吸附带负电的蛋白质带负电的蛋白质) 阳离子交换剂阳离子交换剂(可吸附可吸附带正电的蛋白质带正电的蛋白质)153l阴离子交换剂：阴离子交换剂：l常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基羟丙基l阳离子交换剂：阳离子交换剂：l常用羧甲基常用羧甲基 CM CH2COO l磺丙基磺丙基 SP C3H6SO3DEAE C2H4N+(C2H5)2HQAE C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3154 化学原料合成化学原料合成 ：树脂类物质：树脂类物质 载体载体 天然材料制成：天

60、然材料制成： cellulose cellulose sephadex sepharose 阳离子交换剂阳离子交换剂: 电荷基团（）电荷基团（）, 反离子（）反离子（）电荷基团电荷基团 阴离子交换剂阴离子交换剂: 电荷基团（）电荷基团（）, 反离子（）反离子（） 如：如：DEAE-Sepharose， CM-Sepharose155l以以Sephadex G-25, G-50为骨架，接入离子为骨架，接入离子交换基团。交换基团。l DEAE（QAE） Sephadex A-25，A-50 CM（SP） Sephadex C-25，C-50 A：anion 阴离子阴离子 C: cation 阳离子