人气管上皮细胞对绿脓杆菌抗菌作用观察

1、人气管上皮细胞对绿脓杆菌抗菌作用观察         11-04-21 13:35:00     编辑：studa20               作者：刘燕翔 赵丽君 隋鹏诺 刘珍 王伯瑶 黄宁 吴琦【摘要】  目的：探讨呼吸道上皮细胞与呼吸道致病菌之间的相互关系，观察呼吸道上皮细胞对绿脓杆菌的抗菌作用。方法：(1)贴壁生长的

2、人呼吸道上皮细胞株HBE16与绿脓杆菌标准株ATCC27853共孵育，庆大霉素杀死胞外菌，动态观察上皮细胞内活细菌数;(2)HBE16细胞与绿脓杆菌共同悬浮于细胞培养基，在不同孵育时间点用平板菌落计数法计数活菌数。结果：绿脓杆菌不能在HBE16细胞内生长，并被细胞逐渐清楚。悬浮状态下的HBE16细胞对绿脓杆菌有一定杀菌作用。结论：呼吸道上皮细胞对胞内外绿脓杆菌的抗菌作用，可能是呼吸道抵抗细菌感染的一种天然免疫防御机制。 【关键词】  呼吸道上皮细胞;绿脓杆菌;抗菌作用机体在生物进化过程中，为抵抗微生物的侵袭，发展出各种抗感染防御机制。机体的免疫系统分为天然免疫和获得性免疫，他们共同作

3、用，使机体在复杂的外环境中，维持正常的生命过程。在发生学上最古老的防御机制是天然免疫，其在对抗病原微生物的感染过程中所发挥的作用越来越引起人们的注意1。上皮细胞是天然免疫的重要组成部分，构成机体抵御外来病原微生物的首要防线。研究显示泌尿道、消化道及口腔上皮细胞对细菌有直接抗菌作用2-3。呼吸道上皮细胞是呼吸道防御微生物感染的第一道屏障，绿脓杆菌在自然界中广泛存在，是肺囊性纤维化病人和医院内感染最常见的条件致病菌之一4-6。绿脓杆菌对正常人不致病，只在免疫功能低下或粘膜上皮细胞受损和功能失常的时候才引起感染7。呼吸道上皮细胞在防御这类机会致病菌感染时可能发挥了重要的作用。为了了解呼吸道上皮细胞与

4、绿脓杆菌之间的相互关系，本实验观察呼吸道上皮细胞对绿脓杆菌的抗菌作用。1 材料与方法1.1 材料绿脓杆菌标准株ATCC27853株、人呼吸道上皮细胞株HBE16为本实验室保存。酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂粉为OXOID公司产品。DMEM培养基、非必需氨基酸购自GIBCO公司，新生牛血清购自Hyclon公司，TritonX100购自Sigma，其余试剂为国产分析纯。1.2 细菌的准备从LB平板中挑取单个菌落接种于5mlLB液体培养基中，150转/分振荡培养3-5h，取100l菌液涂布接种于固体LB培养板上。倒置于37°C孵箱培养，16h后收集活菌。用PBS洗涤细菌三次，紫外分光光度计测定

5、650nmOD值，确定细菌的浓度(绿脓杆菌OD650=1.3相当于每mL细菌量109)。1.3 细胞的准备HBE16细胞用含10%新生牛血清的DMEM培养基(无抗生素)，37°C，5%CO2孵箱常规培养。待细胞进入快速生长期，PBS洗涤，胰酶消化，收集并计数确定细胞数量。将HBE16细胞以8×104/孔接种于48孔板，经48小时生长细胞汇合后(细胞数大约为1.2×105/孔)进行实验。1.4 单层贴壁HBE16细胞对胞内绿脓杆菌生长的影响HBE16细胞用PBS洗三次，每孔加入200l DMEM培养基稀释好的ATCC2785细菌(细菌与细胞的数量比分别是10:1，2

6、0:1，50:1)，每个实验组做3复孔。放入37°C，5%CO2孵箱孵育两小时。用PBS洗细胞三次，每孔加入含庆大霉素(100g·mL-1)及10%新生牛血清的DMEM培养基500l，37°C，5%CO2孵箱孵育两小时以杀死细胞外的绿脓杆菌(庆大霉素不进入细胞内，只杀死胞外的细菌)。分别于实验的4小时、24小时用TritonX100裂解细胞，释放出细胞内的活细菌，用平板菌落计数法计算胞内活菌数。实验重复3 次,数验数据以SPSS13.0进行统计学处理，数据以x±s表示，采用t检验。1.5 悬浮状态HBE16细胞对绿脓杆菌的抗菌实验HBE16细胞用含10%

7、新生牛血清的DMEM培养基(无抗生素)，37°C，5%CO2常规培养。待细胞进入快速生长期，PBS洗涤，胰酶消化，收集并计数确定细胞数量。细菌与细胞数按10：1的比例混合，加入EP管(体积为200l)，细胞的终浓度为1×105个/ml，细菌的终浓度为1×106个/ml。实验分二组：对照组只加细菌;实验组加入细胞和细菌，试验采用三复管。放入37，5%CO2的细胞培养箱，分别于孵育后的15min、30min、60min、90min、120min，加入200l 浓度为0.25%的Tritonx100，放置15 min，作10倍系列稀释,每个稀释度取100ul 样品涂布于LB 琼脂平板, 37 温箱培养,菌落计数。实验重复3 次,实验数据以SPSS13.0进行统计学处理，数据以x±s表示，采用t检验。2 结果2.1 绿脓杆菌在贴壁生长HBE16细胞内的存活情况HBE16细胞与绿脓杆菌共孵育(细菌与细胞数比值分别为10：1，20：1，50：1)，以庆大霉素杀灭细胞外