赤芝子实体的化学成分及细胞毒活性的研究(一)资料

1、赤芝子实体的化学成分及细胞毒活性的研究(一)    作者：满淑丽 高文远 颜璐璐 张萱【摘要】 目的对赤芝子实体进行化学成分研究，并对单体化合物进行细胞毒活性测定。方法利用硅胶柱层析，Sephadex LH-20柱色谱以及HPLC等手段分离纯化得到单体化合物，并进行结构鉴定，通过MTT法对其进行细胞毒活性测定。结果从赤芝子实体中分离并鉴定了3个单体化合物的结构，分别是灵芝醇B（），麦角甾醇（）和过氧化麦角甾醇（），这3个化合物对小鼠肺腺癌LA795细胞的IC50分别为77.9，22.5，84.9g/ml。结论3种化合物皆有细胞毒活性，其中以麦角甾醇（）为

2、最好。 【关键词】 灵芝 分离 鉴定 细胞毒活性赤芝Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr.)Karst系担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，具有补中益气、滋外强壮、扶正固本、延年益寿等功效，被列为名贵药材。20世纪70年代以来，我国学者在中西医结合的学术思想指导下，运用现代医药生物技术先后对多种灵芝属真菌的子实体、菌丝体、孢子粉及发酵液的提取物或有效成分进行了系统的化学、药理学研究，对灵芝扶正固本作用的机理进行了有益的探索1。近年来，灵芝有效成分的分析及药理作用，临床应用等的研究已经引起国际上的关注。为了进一步研究其活性成分，本实验对赤芝子实体进行提取分离，得到3个化合物，经鉴

3、定其结构分别为灵芝醇B（ganoderiol B，），麦角甾醇（ergosterol，）和过氧化麦角甾醇（ergosterol peroxide，），其体外抗肿瘤活性作用研究表明对小鼠肺腺癌LA795细胞具有细胞毒活性。1 仪器与材料Gulliver Series高效液相色谱仪(日本JASCO公司)；核磁共振谱仪(VARIAN INOVA 500MHz)；TECAN A-5002 Spectra型酶标仪(奥地利)。实验用硅胶(青岛海洋化工)；Sephadex LH-20(Amersham Pharmacia Biotech)；RPMI1640培养基(Gibco公司)；胎牛血清(天津市庆星科技有

4、限公司)；噻唑蓝(MTT，Sigma公司)；二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)。赤芝Ganoderma lucidum(Fr.)Kart，由天津中新药业提供，经天津大学药物科学与技术学院高文远教授鉴定，植物标本现存于天津大学药物科学与技术学院天然药物学实验室。小鼠肺腺癌LA795细胞株，由中国协和医科大学基础医学研究所提供。2 提取分离将赤芝药材（5 kg）粉碎，用95%的乙醇（药材的10倍量）加热回流提取5h，过滤，滤渣再用10倍量95%乙醇加热回流提取，如此提取5次，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，得提取物250g。将浸膏混悬水溶液分别用石油醚，醋酸乙酯，正丁醇萃取。其中石油醚层部分30g

5、（100200目硅胶400 g装柱），干法上样，采用石油醚醋酸乙酯溶剂系统6个梯度（501，201，101，51，21，01）洗脱，共收集得到12个组份，从其第10个组分中经过硅胶层析分离得到化合物（218.2 mg）。醋酸乙酯层部分40g以（100200目硅胶1000 g装柱）CHCl3-MeOH（100，991，982，955，91，8515，80202，70303， 64，55）梯度洗脱，共得到16个组分，对其第2个组分进行重结晶得到化合物，剩余部分经过凝胶柱层析和正相HPLC分离，得到化合物（10 mg）。3 结构鉴定化合物：白色晶体，1H-NMR(CDCl3，500Hz)H：5.47

6、(1H，d，J=6Hz，7-H)， 5.32(1H，d，J=6.5Hz，11-H)，5.40(1H，t，J=7Hz，24-H)，3.24(1H，dd，J=11.5，4.5)，4.00(2H，s，26-H)，1.67(3H，s，27-H)，1.01(3H，s，29-H)，0.985s(3H，s，30-H)， 0.92(3H，d，J=6.5Hz，21-H)， 0.88(3H，s，28-H)，0.88(3H，s，19-H)， 0.57(3H，s，18-H)。13CNMR数据见表1，以上数据与文献报道2的灵芝醇B相符。化合物 ：白色晶体，1H-NMR(CDCl3，500Hz)H:5.568(1H，d，

7、6-H)， 5.384(1H，d，7-H)，5.204(1H，m，22-H)，5.204(1H，m，23-H)，3.637 (1H，m，3-H)，1.038(3H，d，21-H)，0.946(3H，s，19-H)，0.918(3H，d，25-H)，0.846(3H，d，27H)，0.831(3H，d，28H)，0.631(3H，s，18-H)。以上数据与文献报道的麦角甾醇3相符。分别以氯仿/甲醇(98:2，V/V)，石油醚/乙酸乙酯(1:4，V/V)做层析液，用麦角甾醇标准品作TLC对照，Rf值相同。因此确定为同一化合物。化合物：白色晶体，1H-NMR(CDCl3，500Hz)H:6.50(1

8、H，d，J=8.5Hz，6-H)，6.24(1H，d，J=8.5Hz，7-H)，5.22(1H，dd，J=15，7.5，23-H)，5.14(1H，dd，J=15，8，22-H)，3.95(1H，m，3-H)，0.908(3H，d，J=6.5Hz，21-H)，0.883(3H，s，19-H)，0.83 (3H，d，J=6.5Hz，26-H)，0.82(3H，d，J=6.5Hz，27H)，1.00(3H，d，J=6.5Hz，28H)，0.816(3H，s，18-H)。13CNMR数据见表1，以上数据与文献报道4的麦角甾醇过氧化物相符。表1 化合物、的13CNMR光谱数据4 细胞毒活性测定4.1

9、细胞培养小鼠肺腺癌LA795细胞株，为贴壁细胞，培养于含10%灭活胎牛血清，100 U/ml 青霉素，100g /ml 链霉素的 RPMI1640培养液中，37，5%CO2培养箱及饱和湿度条件下培养，34 d 传代一次。4.2 MTT法将对数生长期细胞用胰酶消化后配制成浓度为3×104个/ml的细胞悬液，接种于96孔酶标板，每孔加200 l。24 h后换不含血清RPMI1640培养液使细胞同步化生长，每孔200 l。24h后(第 3 天)加含不同浓度药物及相应溶媒对照的新鲜培养液，每孔加200 l，受试药设4个剂量组，每组设8个平行孔，并设空白孔调零。在上述条件下培养24 h后，每孔

10、加无血清培养液新鲜配制的0.5 mg/ml MTT 100 l，继续培养4 h，然后每孔加100 l DMSO溶解MTT甲簪颗粒，用微型振荡器振荡混匀后，于酶标仪上测定光密度值(OD) ，实验重复 3 次，取平均值。以溶剂对照处理肿瘤细胞为对照组，由OD值计算抑制率，细胞生长抑制率(%)=（1-样品组OD值对照组OD值）×100。并由此求得IC50(半数抑制浓度) ，IC50=细胞生长抑制率为50%的药物浓度。实验结果见表2，显示化合物对小鼠肺腺癌细胞LA795具有一定的细胞毒活性，其中以化合物为最好。表2 3 种化合物的细胞毒活性5 结论从赤芝子实体中分离得到3种单体化合物，并对其进行了体外细胞毒活性研究。结果显示，在测定浓度范围内3种