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文档简介
1、赤芝子实体的化学成分及细胞毒活性的研究(一) 作者:满淑丽 高文远 颜璐璐 张萱【摘要】 目的对赤芝子实体进行化学成分研究,并对单体化合物进行细胞毒活性测定。方法利用硅胶柱层析,Sephadex LH-20柱色谱以及HPLC等手段分离纯化得到单体化合物,并进行结构鉴定,通过MTT法对其进行细胞毒活性测定。结果从赤芝子实体中分离并鉴定了3个单体化合物的结构,分别是灵芝醇B(),麦角甾醇()和过氧化麦角甾醇(),这3个化合物对小鼠肺腺癌LA795细胞的IC50分别为77.9,22.5,84.9g/ml。结论3种化合物皆有细胞毒活性,其中以麦角甾醇()为
2、最好。 【关键词】 灵芝 分离 鉴定 细胞毒活性赤芝Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr.)Karst系担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌,具有补中益气、滋外强壮、扶正固本、延年益寿等功效,被列为名贵药材。20世纪70年代以来,我国学者在中西医结合的学术思想指导下,运用现代医药生物技术先后对多种灵芝属真菌的子实体、菌丝体、孢子粉及发酵液的提取物或有效成分进行了系统的化学、药理学研究,对灵芝扶正固本作用的机理进行了有益的探索1。近年来,灵芝有效成分的分析及药理作用,临床应用等的研究已经引起国际上的关注。为了进一步研究其活性成分,本实验对赤芝子实体进行提取分离,得到3个化合物,经鉴
3、定其结构分别为灵芝醇B(ganoderiol B,),麦角甾醇(ergosterol,)和过氧化麦角甾醇(ergosterol peroxide,),其体外抗肿瘤活性作用研究表明对小鼠肺腺癌LA795细胞具有细胞毒活性。1 仪器与材料Gulliver Series高效液相色谱仪(日本JASCO公司);核磁共振谱仪(VARIAN INOVA 500MHz);TECAN A-5002 Spectra型酶标仪(奥地利)。实验用硅胶(青岛海洋化工);Sephadex LH-20(Amersham Pharmacia Biotech);RPMI1640培养基(Gibco公司);胎牛血清(天津市庆星科技有
4、限公司);噻唑蓝(MTT,Sigma公司);二甲基亚砜(DMSO,Sigma公司)。赤芝Ganoderma lucidum(Fr.)Kart,由天津中新药业提供,经天津大学药物科学与技术学院高文远教授鉴定,植物标本现存于天津大学药物科学与技术学院天然药物学实验室。小鼠肺腺癌LA795细胞株,由中国协和医科大学基础医学研究所提供。2 提取分离将赤芝药材(5 kg)粉碎,用95%的乙醇(药材的10倍量)加热回流提取5h,过滤,滤渣再用10倍量95%乙醇加热回流提取,如此提取5次,合并滤液,减压浓缩至浸膏状,得提取物250g。将浸膏混悬水溶液分别用石油醚,醋酸乙酯,正丁醇萃取。其中石油醚层部分30g
5、(100200目硅胶400 g装柱),干法上样,采用石油醚醋酸乙酯溶剂系统6个梯度(501,201,101,51,21,01)洗脱,共收集得到12个组份,从其第10个组分中经过硅胶层析分离得到化合物(218.2 mg)。醋酸乙酯层部分40g以(100200目硅胶1000 g装柱)CHCl3-MeOH(100,991,982,955,91,8515,80202,70303, 64,55)梯度洗脱,共得到16个组分,对其第2个组分进行重结晶得到化合物,剩余部分经过凝胶柱层析和正相HPLC分离,得到化合物(10 mg)。3 结构鉴定化合物:白色晶体,1H-NMR(CDCl3,500Hz)H:5.47
6、(1H,d,J=6Hz,7-H), 5.32(1H,d,J=6.5Hz,11-H),5.40(1H,t,J=7Hz,24-H),3.24(1H,dd,J=11.5,4.5),4.00(2H,s,26-H),1.67(3H,s,27-H),1.01(3H,s,29-H),0.985s(3H,s,30-H), 0.92(3H,d,J=6.5Hz,21-H), 0.88(3H,s,28-H),0.88(3H,s,19-H), 0.57(3H,s,18-H)。13CNMR数据见表1,以上数据与文献报道2的灵芝醇B相符。化合物 :白色晶体,1H-NMR(CDCl3,500Hz)H:5.568(1H,d,
7、6-H), 5.384(1H,d,7-H),5.204(1H,m,22-H),5.204(1H,m,23-H),3.637 (1H,m,3-H),1.038(3H,d,21-H),0.946(3H,s,19-H),0.918(3H,d,25-H),0.846(3H,d,27H),0.831(3H,d,28H),0.631(3H,s,18-H)。以上数据与文献报道的麦角甾醇3相符。分别以氯仿/甲醇(98:2,V/V),石油醚/乙酸乙酯(1:4,V/V)做层析液,用麦角甾醇标准品作TLC对照,Rf值相同。因此确定为同一化合物。化合物:白色晶体,1H-NMR(CDCl3,500Hz)H:6.50(1
8、H,d,J=8.5Hz,6-H),6.24(1H,d,J=8.5Hz,7-H),5.22(1H,dd,J=15,7.5,23-H),5.14(1H,dd,J=15,8,22-H),3.95(1H,m,3-H),0.908(3H,d,J=6.5Hz,21-H),0.883(3H,s,19-H),0.83 (3H,d,J=6.5Hz,26-H),0.82(3H,d,J=6.5Hz,27H),1.00(3H,d,J=6.5Hz,28H),0.816(3H,s,18-H)。13CNMR数据见表1,以上数据与文献报道4的麦角甾醇过氧化物相符。表1 化合物、的13CNMR光谱数据4 细胞毒活性测定4.1
9、细胞培养小鼠肺腺癌LA795细胞株,为贴壁细胞,培养于含10%灭活胎牛血清,100 U/ml 青霉素,100g /ml 链霉素的 RPMI1640培养液中,37,5%CO2培养箱及饱和湿度条件下培养,34 d 传代一次。4.2 MTT法将对数生长期细胞用胰酶消化后配制成浓度为3×104个/ml的细胞悬液,接种于96孔酶标板,每孔加200 l。24 h后换不含血清RPMI1640培养液使细胞同步化生长,每孔200 l。24h后(第 3 天)加含不同浓度药物及相应溶媒对照的新鲜培养液,每孔加200 l,受试药设4个剂量组,每组设8个平行孔,并设空白孔调零。在上述条件下培养24 h后,每孔
10、加无血清培养液新鲜配制的0.5 mg/ml MTT 100 l,继续培养4 h,然后每孔加100 l DMSO溶解MTT甲簪颗粒,用微型振荡器振荡混匀后,于酶标仪上测定光密度值(OD) ,实验重复 3 次,取平均值。以溶剂对照处理肿瘤细胞为对照组,由OD值计算抑制率,细胞生长抑制率(%)=(1-样品组OD值对照组OD值)×100。并由此求得IC50(半数抑制浓度) ,IC50=细胞生长抑制率为50%的药物浓度。实验结果见表2,显示化合物对小鼠肺腺癌细胞LA795具有一定的细胞毒活性,其中以化合物为最好。表2 3 种化合物的细胞毒活性5 结论从赤芝子实体中分离得到3种单体化合物,并对其进行了体外细胞毒活性研究。结果显示,在测定浓度范围内3种
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