动静力失衡性大鼠颈椎间盘组织形态学及超微结构

1、动静力失衡性大鼠颈椎间盘组织形态学及超微结构         08-07-03 10:11:00     编辑：studa20                作者：李晨光，王拥军，施杞，胡志俊，周泉，刘梅，周重建【关键词】  动静力失衡    摘  要：目的动态观察大鼠

2、颈部动、静力失去平衡后颈椎间盘组织形态学及超微结构的改变。方法SD大鼠60只，随机分为3、5、7个月模型组和对照假手术组，每组10只，通过破坏大鼠颈部肌肉、韧带诱导颈椎间盘退变，按月取材。各组椎间盘HE、Toluidine blue染色，在光镜下观察用体视学分析软件、Dissector自动计数法分析软骨终板内血管芽的数量、面积和软骨终板的厚度，Miyamoto分级法综合评判颈椎间盘退变的程度；透射电镜观察椎间盘细胞凋亡的超微结构。结果与对照假手术组比较，3个月造模组动物颈椎间盘已开始退行性变化，纤维环板层结构紊乱，关节软骨钙化层增厚，软骨下血管明显减少；5个月模型组髓核完全纤维化，纤维环板层状

3、结构消失，血管芽稀少，血管壁充血曲张；7个月模型组椎间盘内部结构与5个月模型组相似，部分椎体边缘骨赘形成。在电镜下，3个月造模组椎间盘细胞，细胞表面突起减少，细胞器稀少，胞质内有脂滴，可见到凋亡细胞形成的凋亡小体。5个月和7个月模型组椎间盘组织中细胞较少，基质中胶原纤维断裂，可见到许多坏死空化的细胞。结论模型组大鼠颈椎间盘都出现典型的退变形态学变化，随着造模月份的延长退变程度越严重；早期和中期退变椎间盘中可观察到凋亡细胞，在退变的晚期可观察到坏死细胞。   关键词：动静力失衡；  椎间盘；  形态学；  超微结构；  动物模型

4、0;    Abstract：ObjectiveTo observe the histomorphology and ultrastructure of the intervertebral disc ( I D ) in the rat model with cervical vertebral unbalance of dynamic and static forceMethodSixty SD rates were randomly divided into 4 groups: 3 months,5 months,7 months and the contr

5、ol groupThe cervical I D degeneration model was made by destroying the neck muscle of rats and the tissues wer collected every monthThe number,area and thickness of the cartilage endplate were measured by the means of Miyamoto's ClassesThe ultrastructure of the apoptosis cells of the interverteb

6、ral disc was observed under the electron microscopeResultCompared with the control group,the 3 months group showed degeneratin changes,with disordered structure of the annular fibrosis and thickness increase of calcification layer and decrease of blood vessel unmber in the cartilage layerComplete fi

7、brosis was found in nucleus pulposus in 5 months model group,with the fibro lamellar structure disappeared and few blood vessel budsThe features of 7 months model group was similar to 5 months and osteophyma had been formed near the bordr of part intervertebalUnder the electron microscope,the number

8、 of surface projection and organelles was decreasedFatty drop and apoptotic body could be seen in disc cells of 3 month model groupFew cells,broken collagen fibers in ECM and more cavitation cells for necrosis in 5 months and 7months model groups could be seenConclusionThe cervical I D of model grou

9、ps has shown typical morphological changes of degeneration and this trend was more serious with the time passingIn the early and middle stage of degeneration,the apoptosis cells can be seen,but in the terminal stage the cellular necrosis was more common   Key words：Unbalance;  Interve

10、rtebral disc;  Histomorphology;  Ultrastructure;  Animal model   1  材料与方法   11  实验动物   选择3个月龄SPF级SD大鼠，雄性60只，体重（300±20）g左右。随机分为3、5、7个月模型组和对照假手术组，每组10只。由上海中医药大学动物中心提供，合格证号：“SYXK（沪）20042005”：动物实验环境等级：SPF级。   12  造模方法1、2 

11、60; 取大鼠颈背部正中纵向切口，长约2025 cm，切开皮肤后，充分游离各层肌肉，横向切断深层颈夹肌和头、颈、寰最长肌，完全切除颈髂肋肌和头半脊肌，然后再依次切断C27棘上和棘间韧带。假手术组仅切开皮肤后缝合。   13  取材方法   腹腔注射过量麻醉处死大鼠，取颈部椎间盘，在4倍手术显微镜下沿上、下软骨终板与椎体的交界面切下椎间盘。   14  椎间盘组织染色方法   椎间盘取材后，每组10个标本，多聚甲醛固定24 h，EDTA脱钙，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡机包埋，正中额状面连续6

12、m切片。染色程序如下。   141  HE染色   常规脱腊至水自来水冲洗5 min苏木素染液2 min自来水冲洗盐酸乙醇分化氨水蓝化伊红染液 1 min乙醇分化二甲苯透明中性树胶封固。   142  Toludine blue染色   常规脱蜡至水滴加1甲苯胺蓝液染色6 min蒸馏水洗95乙醇急速分化无水乙醇脱水二甲苯透明中性树胶封固。   15  电镜观察   3、5、7个月模型组和对照假手术组，按月取材后，将每组标本取C5、6间盘戊二醛固定

13、24 h，EDTA脱钙2周，刀片正中矢状面剖开，二甲砷酸缓冲液充分洗涤，1的锇酸溶液作后固定2 h，梯度乙醇脱水，环氧树脂浸泡包埋，超薄切片机切片，厚500600 ，枸椽酸铅枸椽酸铀双染色，透射电镜观察并拍照。   16  数据采集和测量   光镜下对颈椎间盘组织形态学观察，每个标本取2张连续切片观察，按Miyamoto等的分级标准对椎间盘评分（表1）。表1  Miyamoto评分标准161  软骨终板血管芽数量、面积测量   Disector自动计数法和体视学分析法。各组取6个标本，各个标本连续6 m切

14、片2张，显微镜下采集图像，尺寸定标，形成图形数据，输入切片间距，医学图像分析软件自动分析。   162  软骨终板钙化层，非钙化层厚度测量   体视学分析法。采用组织病理学切片，以潮标为分界线，40倍显微镜下，测定每组6个椎间盘软骨终板正中额状面前侧13、中心点、后侧13钙化层和非钙化层的厚度，取3处测量的平均值。   17  统计分析   SPSS 110软件包，One Way ANOVA统计，平均数±标准差（x-±s）表示。   2  结&#

15、160; 果   21  光镜下椎间盘组织形态学观察结果   211  正常颈椎间盘结构的大致形态学描述   采用HE和Toluidine blue染色，在光镜×1020倍下，可见到椎间盘额状面呈椭圆形，中心是髓核区，胶原纤维排列呈网状，髓核细胞较小，呈圆形，散在其中；外周环绕的是纤维环区，大量胶原纤维排列如同心圆状，纤维环细胞为长梭形状，核呈长柱状，染色深；上下紧邻椎体的是软骨终板，HE染色可见到一条波浪形的潮线，是钙化层和非钙化层的标志线，即潮标（tidemark）。软骨细胞较大，比髓核细胞大23倍，

16、3、5成簇的散在于卵圆形的纤维软骨陷窝囊中，核呈圆形，Toluidine blue染色呈深蓝色（图15）。   212  假手术组   3、5个月假手术组动物颈椎间盘基本显示正常结构，外周由规则排列的纤维环和中央大的髓核组成；软骨板分为生长软骨层和关节软骨层；关节软骨层由一薄层透明软骨组成，与继发性骨化中心相连接的透明软骨钙化，潮标清晰可见，钙化的关节软骨极薄，钙化软骨与骨髓腔直接接触或与一薄层骨板相邻，钙化的软骨下分布有大量粗大血管（图1）。   213  造模组   3个月造模组动物颈椎间盘已开始