植酸酶的检测方法-饲用植酸酶活性的测定(精)

1、饲用植酸酶活性的测定分光光度法1 范围本标准规定了以分光光度法测定饲用植酸酶活性的方法。本标准适用于作饲料添加剂用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。样品最低检出量为90Ukg。2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。 所有标准都会被修订， 使用本标准的各方应探讨使用下列标准的最新版本的可能性。GB T 6682 1992 分析实验室用水规格和试验方法(neq ISO 3696： 1987)3 植酸酶活性单位定义样品在植酸钠浓度为5.0 mmol L、温度 37、 PH值 5.00 的条件下

2、，每分钟从植酸钠中释放1 mol 无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U 表示。4方法原理植酸酶在一定温度和pH 条件下， 水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的(NH 4) 3PO4NH4VO316MoO3 复合物，在波长415nm下进行比色测定。5试剂和溶液本标准中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB T 6682中规定的三级水。清洗试验用容器不要用含磷清洗剂。5.1 0.25mol L 乙酸缓冲液 (I)称取 34.02g 三水乙酸钠于1000mL容量瓶中，加入900mL水溶解，用冰醋酸调节pH 至5.00 0.01 ，并用蒸馏

3、水定容至1000mL，室温下存放2 个月有效。5.20.25mol L 乙酸缓冲液 ( )称取 34.02g 三水乙酸钠， 0.5g TritonX-100,0.5g牛血清白蛋白（BSA）于 1000mL 容量瓶中，加入900mL水溶解，用冰醋酸调节pH 至 5.00 0.01 ，并用蒸馏水定容至1000mL，室温下存放2 个月有效。5.37.5mmol/L植酸钠溶液c(C 6H6O24P6Na12) 为 7.5mmol L称取 0.6929g肌醇六磷酸钠 (C6H6O24P6Na12) 于 100mL。容量瓶中，用0.25mol L 乙酸缓冲液 (5.1) 溶解并定容至刻度，用冰醋酸调节pH

4、 至 5.00 0.01 ，现用现配 ( 实际反应液中的最终浓度为5.0 mmol L) 。5.4硝酸溶液： 1+2 水溶液。5.5100g L 钼酸铵溶液称取 10g 钼酸铵 (NH 4)6Mo7O24 4H2O于 100mL。容量瓶中，加入1.0mL 氨水 (25 ) 用水溶解定容至刻度。5.62.35 g L 钒酸铵溶液第1页共4页称取 0.235 g钒酸铵 (NH VO) 于 100mL 棕色容量瓶中，加入2 mL 硝酸溶液 (5.4)，用水43溶解定容至刻度。避光条件下保存一周有效。5.7颜色终止液移取 2 份硝酸溶液 (5.4) ， 1 份钼酸铵溶液 (5.5)， 1 份钒酸铵溶液

5、 (5. 6)混合后使用，现用现配。 ( 注意：不要有白色乳状沉淀，加硝酸要慢)5.8植酸酶标准品 ( 标明准确活性单位和类型 ) 。5.9磷酸二氢钾 (KH2PO4) ：基准物。6 仪器和设备6.1实验室常用仪器设备。6.2恒温水浴： (37 0.1) 。6.3分光光度计：有10mm比色皿，可在415nm下测定吸光度。6.4磁力搅拌器。6.5涡流式混合器。6.6酸度计：精确至小数点后2 位。6.7离心机：转速为4000r min 以上。7 试样制备取有代表性样品，用四分法将试样缩分至200g，植酸酶产品不需粉碎，配合饲料和添加剂预混合饲料需粉碎通过0.45mm标准筛，装入密封容器，防止试样成

6、分变化。8 测定步骤8.1绝对法 ( 仲裁法 )标准曲线准确称取0.6804g 在 105烘至恒重的基准磷酸二氢钾(5.9)于 100mL容量瓶中， 用乙酸缓冲液 (5.2)溶解，并定容至100mL浓度为 50.0mmol L。按表1 的比例稀释成不同浓度，与试样一起反应测定，以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程(y ax+b) 。表 1标准序号稀释量 mL浓度 (mmolL)10.5 12520.5 212.530.5 46.2540.5 83.12550.5 161.562 5试样溶液的制备按照附录A 中建议的称样量称取试样两份，精确至0.0001 g ，置于 100 m

7、L 容量瓶中，加入约 70mL乙酸缓冲液 (5.2) ，一个磁力棒，在磁力搅拌器 (6.4) 上高速搅拌 30min，用乙酸缓冲液 (5.2) 定容至刻度 ( 减去磁力棒的体积 ) 。摇匀，在离心机 (6.7) 上以 4 000r min 离心 10min。分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液(5.2)稀释（一般取2ml 上清夜到50ml容量瓶中），使样液浓度保持在0.4U mL。左右，待反应。建议在测定样品时附加一个已知活性的植酸酶参考样，便于检验整个操作过程是否有偏差。第2页共4页以玉米芯、麸皮等为载体时可提高缓冲液5.2 中 TritonX-100 及 BSA的浓度至 0.5%8.1.3反应

8、取 10mL试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物(5.3)开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，37水解 30min 。反应步骤及试剂、溶液用量见表2。表 2反应顺序样品、标准样品空白 ( 标准空白 )1. 加乙酸缓冲液 (5.1 或 5.2)1.8 mL1.8 mL(2.0 mL)2. 加入待反应液0.2 mL0.2 mL3. 混合437预热 5 min5. 依次加入底物 (5.3)4 mL4 mL( 第二步 )6. 混合7.37 水解 30min8. 依次加入终止液 (5.7)4 mL4mL(第一步 )9. 混合总体积10 mL10 mL8.1.4样品测定反应后

9、的试样在室温下静置10min ，如出现混浊需在离心机(6.7)上以 4 000rmin离心 10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计(6.3)415 nm波长处测定样品空白 (A 。) 和样品溶液 (A) 的吸光值， A-A0。为实测吸光值。 用直线回归方程计算植酸酶的活性。9 结果计算和表示9.1计算公式试样中植酸酶的活性, 用每克 ( 或 ml) 试样中的活性单位“ U”表示,计算公式如下：绝对法U式中：cF (1)m30U试样中植酸酶的活性，UgC根据实际样液的吸光值由直线回归万程计算出的x 值， U；F试样溶液反应前的总稀释倍数。m试样质量，g 或 mL30反应时间，min9.2结果表示两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留整数。9.3重复性同一样品两个平行测定值的相对偏差