蛋白质的化学修饰

1、第三章 酶蛋白的化学修饰付跃 陈鑫鑫 张峰学习目标1. 能够定义酶的选择性化学修饰2. 了解化学修饰的基本原理、影响酶功能基反应性因素3. 说明如何选择酶修饰剂、如何控制修饰程度和修饰部位及如何测定酶修饰部位和酶修饰程度4. 明确可被化学修饰的侧链基团和酶修饰剂5. 熟悉双功能试剂的类型、专一性及用途6. 定义亲和标记、了解亲和试剂分类及其优缺点7. 表述酶化学修饰在理论研究和生产实际中的应用本章主要内容l第一节 化学修饰的原理l第二节 化学修饰的方法学l第三节 蛋白侧链的修饰l第四节 酶的亲和修饰l第五节 酶的化学交联l第六届 酶化学修饰的应用第一节 化学修饰的原理 影响蛋白质化学修饰反应进

2、程的因素主要有两个：一是蛋白质功能基的反应性；二是修饰剂的反应性。一、影响酶蛋白功能基反应性的因素二、酶蛋白功能基的超反应性三、修饰剂反应性的决定因素一、影响酶蛋白功能基反应性的因素影响酶蛋白功能基反应性的因素 蛋白质功能基所处的环境影响蛋白质的物理化学性质，蛋白质分子表面特点也影响化学试剂的接近，因此有必要研究局部微区对功能基和修饰剂的作用。由于功能基的反应性是通过他的亲和性来测量的，而亲和性往往与它的酸碱性有关，因此应该强调pKa和影响pKa的因素。影响酶蛋白功能基反应性的因素1、 微区极性 微区极性是决定集团解离状态的关键因素之一，乙酸的pKa在水中为4.76，在80的乙醇中为6.87，

3、在100的乙醇中增至10.32，随着介质极性降低，羧基的pKa升高。影响酶蛋白功能基反应性的因素2 、氢键效应 天然的蛋白质或它的离子通过氢键来维持稳定性，也是使pKa发生改变的一个因素。例如2-氟酚的pKa比2-溴酚的pKa高0.7.这不是由于空间原因，而是由于氟与酚形成氢键的能力比溴强。影响酶蛋白功能基反应性的因素3 、静电效应 用高分辨率的核磁共振对组氨酸残基的电离行为进行研究表明不同蛋白质中组氨酸残基的pKa是不同的。例如，碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基。 碳酸酐酶的pKa是：5.91；6.04；7.00；7.23 葡萄球菌核酸酶的pKa是：5.37；5.71；5.74；6

4、.50 组氨酸残基在这两个蛋白质中的pKa范围是5.37-7.23，几乎相差2。模型化和物的数据指出，这些变化可能是由于带电集团相互影响所致。 蛋白质中个别功能基所处微区不同，反应性也不同。个别功能基的反应性只能通过实验来测定。影响酶蛋白功能基反应性的因素影响酶蛋白功能基反应性的因素4、位阻效应 处于蛋白质表面的功能基比较容易与修饰剂反应，但是，如果烷基在空间上紧靠功能基，会使修饰剂不能与功能基接触，这是就出现了位阻效应。影响酶蛋白功能基反应性的因素 对枯草杆菌蛋白酶BPN的X衍射研究指出，它的所有10个氨基酸残基全都在分子表面，而且苯酚的羟基几乎在所有情况下都没有形成氢键，但是如果对他进行彻

5、底的硝化和氧化后，10个酪氨酸中只有8个被氧化，还有2个没有被氧化的原因可能是空间障碍引起的。小结 影响功能基反应性因素可归纳为两个方面；一是微区极性、集团之间的氢键静电相互作用等因素对功能基pKa的影响；二是集团之间的空间障碍。二、酶蛋白功能基的超反应性酶蛋白功能基的超反应性 功能基的反应性比较复杂，超反应就是州二中复杂性的表现之一。 超反应是指蛋白质的某个侧链集团与个别试剂能发生非常迅速的反应。酶蛋白功能基的超反应性 影响超反应的因素有很多，其中包括：改变蛋白质功能基pKa；蛋白质功能基具有较大的亲和性；通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当的取向；试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体

6、化学适应性；试剂结合等。 用2，4-二硝基氟苯选择性芳基化人碳酸酐酶B的第204号组氨酸，看来主要是由于该集团pKa值非常低。酶蛋白功能基的超反应性 一般来说，酶活性部位的极性是低的，这特别有助于加强在活性部位上的静电作用。 蛋白质的空间结构和试剂的空间结构之间的相互影响，也能加强修饰反应速度和反应专一性。例如对核糖核酸酶A第119号组氨酸和第12号组氨酸的烷化，使用不同的试剂，这两个残基的反应速度也不同。三、酶蛋白功能基的超反应性酶蛋白功能基的超反应性 加快反应速度的一个重要原因是限制了构象的总数（即限制旋转自由度），例如在同一碳原子上引入2个甲基，则限制了集团的自由旋转，因而使酚酸的酯化速

7、度常数提高108倍以上。修饰剂反应性的决定因素1 、选择吸附 正像酶-底物复合物一样，蛋白质-修饰剂复合物形成后，修饰过程的速度加强了，这种速度加强，部分是由于选择性吸附的结果。例如：D-氨基酸氧化酶的巯基与一系列N-烷基马来酰亚胺的反应表明，巯基的辛基化速度比乙基化速度高15倍。这说明，巯基处于非极性环境中。修饰剂先于蛋白质的巯基疏水键合，然后烷基化。修饰剂反应性的决定因素2、静电相互作用 带电的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的部位，静电相互作用可使修饰剂向多功能部位中的一个残基定位或双功能基的一侧定位。修饰剂反应性的决定因素3、位阻因素 蛋白质表面的位阻因素或者底物、辅因子、

8、抑制剂产生的位阻因素都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。例如：用-溴代丁酸可烷化核糖核酸酶第12号组氨酸，而且反应进行很快；若用-溴代戊酸做修饰剂，则很难进行反应；用-溴带己酸则不能发生烷化反应。说明，如果修饰剂的大小超过结合部位的大小则不能发生修饰反应。修饰剂反应性的决定因素4、催化因素 修饰部位附近的其他功能基，如果起一般的酸碱作用，也能影响修饰剂反应。不同的修饰剂，其反应速度和反应部位有明显的差异。对硝基苯乙酸盐和苯乙酸盐对胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸的乙酰化属于同一机理，但苯乙酸盐的反应性差，在很大程度上与酶的酸碱催化有关。修饰剂反应性的决定因素5 、局部环境的极性 许多反应的速度与极性有

9、关，而有些反应与极性无关。反应类型反应类型降低极性对速度影响降低极性对速度影响（1）RSR+ICH2CONH2 R2S+CH2CONH2I-（2）RSR+H2O2 R2SO +H2O（3）RS-+ICH2CONH2 RSCH2CONH2+I-（4）RNH3+OCN-+RNHCONH2适当降低或大大降低没有影响没有影响适当增加或大大增加修饰剂反应性的决定因素 疏水环境能阻止产物中电荷的分离的反应反应类型(1)，并能加速电荷的中和反应反应类型(4)；对于反应(2)（没有电荷分离）和反应(3)（电荷只能从一个离子转移到另一个离子），则介质的极性是不重要的。第二节 化学修饰的方法学一、修饰反应专一性的

10、控制二、修饰程度和修饰部位的测定三、化学修饰结果的解释一、修饰反应专一性的控制修饰反应专一性的控制1、试剂的选择 用于修饰酶活性部位的氨基酸残基的试剂应具备以下一些特征：选择性的与一个氨基酸残基反应；反应在酶蛋白不变性的条件下进行；标记的残基在肽中稳定，容易通过降解分离出来，进行鉴定；反应的程度能用简单的技术测定修饰反应专一性的控制2 、反应条件的选择 蛋白质与修饰剂作用所要求的反应条件，除修饰能顺利进行外，还必须满足如下要求，一是不造成蛋白质的不可逆变性。而是有利于专一性修饰蛋白修饰反应专一性的控制3、反应的专一性 在蛋白质的化学修饰中，反应的专一性非常重要，若修饰剂的专一性较差，除控制反应

11、条件外还可以通过其他途径来实现修饰的专一性。修饰反应专一性的控制 （1）利用蛋白质分子中某些集团的专一性 活性蛋白质特殊的空间结构能影响某些集团的活性，二异丙基磷酸酯（DFP）能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸作用，结果迅速导致酶失活，但DFP在同样的条件下不能与胰凝乳蛋白酶原及一些简单的模拟化合物作用。在蛋白质分子中，特别是活泼集团，如上述活性丝氨酸在适当的条件下只是其本身发生作用，而其他集团均不发生作用，这种现象称为“位置专一性”。修饰反应专一性的控制（2） 选择不同的反应pH 在蛋白质分子中各功能基的解离常数是不一样的，所以控制不同的反应pH，也能控制各各功能基的解离程度，从而有利于修饰的专一

12、性。例如，用溴带乙酸对蛋白质进行修饰时，试剂可与半胱氨酸，甲硫氨酸，组氨酸侧链及-氨基、-氨基发生作用。当反应pH为6时，只专一地与组氨酸的咪唑基作用，当反应的pH为3时，则专一地与甲硫氨酸侧链作用。修饰反应专一性的控制（3）利用某些产物的不稳定性 在高pH下，用氰酸、二硫化碳等，可将氨基转变成脲和胍的衍生物。修饰反应专一性的控制（4）亲和标记 亲和标记是实现专一性修饰的重要途径。亲和标记试剂除了与蛋白质作用外，还要求试剂的结构和与蛋白质作用的底物或抑制剂相似。因此，在作用前，试剂先以非共价形式结合到蛋白质的活性部位上，然后再发生化学作用，将试剂置于活性部位的集团上。这种方法在研究酶的活性部位

13、时有特别的作用。例如，对甲基苯磺酰氟能作用于胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸上。修饰反应专一性的控制（5） 差别标记 在底物或抑制剂存在下进行化学修饰时候，由于他们保护着蛋白质的活性部位基团，使这些基团不能与试剂作用，然后将过量底物或抑制剂除去，多得到的部分修饰的蛋白质再与含同位素标记的同样试剂作用，结果只有原来被底物抑制剂保护的基团是带放射性同位素标记的。用这一方法可以直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。修饰反应专一性的控制（6） 利用蛋白质状态的差异 有时在结晶状态下反应，可以提高修饰的专一性。核糖核酸酶在晶体状态下进行羧甲基化时，反应主要集中在119号组氨酸上，对12号组氨酸的修饰很少，两者之

14、比为60：1。但是在水溶液进行同样的修饰时，两者之比为15:1，在晶体状态下羧甲基化专一性比溶液状态下提高3倍。二、修饰程度和修饰部位的测定修饰程度和修饰部位的测定1、分析方法 最常用的方法是间接法。被修饰的蛋白质经总降解和氨基酸分析后鉴定修饰部位。被修饰的残基经分离纯化后可通过它含有同位素标记量或通过有色修饰剂的光谱强度、顺磁共振普、荧光表计量等测定反应程度。有些修饰了的残基在即使在酶解条件下也不稳定，这时常进行残基部位的第二次修饰，以产生另为一些更稳定的修饰。由第二次的修饰结果可以得到第一次的修饰程度。例如，已经乙酰化的蛋白质再经二硝基苯酰化，然后酸水解，测定DNP-氨基酸和回收氨基酸的数

15、目，在于总数比较就知道修饰程度了。修饰程度和修饰部位的测定 2 化学修饰数据分析 （1）化学修饰时间进程分析修饰程度和修饰部位的测定（2）确定必须集团的性质和数目 蛋白质分子中某类侧链基团在功能上虽有必需和非必需之分，但他们往往都能与某一试剂起反应，长期以来人们没有找到生物活力与必需集团之间的定量关系，也就无法从实验数据中确定必须集团的性质和数目。1962年邹承鲁提出同居学方法，建立了所谓的邹氏作图法，不仅为蛋白质修饰研究由定性描述转入定量研究提供了理论依据和研究方法，而且确定蛋白质集团也是蛋白质工程设计的必要前提。三、 化学修饰结果的解释化学修饰结果的解释1、蛋白质功能改变的解释 判断修饰剂是否发生在活性部位上，通常的方法有： 如果修饰发生在活性部位或必需的集团上，则蛋白质活性的丧失与修饰程度一定呈某种化学计量关系。采用可逆的保护剂时，修饰失活的蛋白质随保护基的去除可重新恢复活力，而且恢复程度应与保护基的去除量呈一定比例关系。化学修饰结果的解释2、修饰残基不稳定性 原始修饰后还可能发生共价改变。蛋白质中碘带酪氨酸相当不稳定，除对光和氧敏感外，在层析过程中，有碘离子存在