人参果中人参皂苷分离技术及提取物HPLC指纹图谱研究

1、中国农业科学院硕士学位论文人参果中人参皂苷分离技术及提取物HPLC指纹图谱研究姓名：孙成贺申请学位级别：硕士专业：野生动植物保护与利用指导教师：王英平20080501摘要为了深入开发利用人参果资源，本文应用现代植物化学分离手段，研究了人参果中人参皂苷大孔吸附树脂提取和高速逆流色谱分离；在此基础上，对其部分化学成分进行分离及结构鉴定研究。为人参果资源的高效开发及可持续利用奠定理论及方法学基础。本项研究取得了如下进展：首次应用高速逆流色谱（）对人参果中人参皂苷进行了制备性分离。以乙酸乙酯一正丁醇一水（：，下相）为溶剂系统，主机正转，转速，流速，固定相保留率，人参皂苷保留时间为，所得人参果皂苷经分析

2、，纯度达到。对人参果皂苷大孔吸附树脂吸附提取工艺进行了研究，采用高效液相色谱法以、。、和：作为对照品，种人参皂苷总和作为指标对一、一、和型大孔吸附树脂进行了比较，对比了筛选出适合于人参果中皂苷富集的型大孔吸附树脂，同时也对型大孔吸附树脂的洗脱系统进行了研究。采用超声提取结合大孔吸附树脂层析柱、硅胶中压柱色谱对人参皂苷化学成分进行了分离制备。大孔吸附树脂洗脱部分进行常规柱层及中压柱层析分离，得到个化合物、和，经理化鉴定和有机波谱鉴定，确定其化合物分别为：人参皂苷、和。建立人参果提取物指纹图谱。色谱柱，（），以流动相：乙腈，：水，梯度洗脱，：；，：；，：。检测波长，流速；柱温。根据批次供试品测定结

3、果，经与参照物对照以及比较所有测定和记录的色谱图，标定共有指纹峰个，指纹图谱相似度均，经过稳定性、重现性、精密度考察，表明该方法稳定、可靠，可操作性强。本文创新点如下：首次采用分离制备人参果中人参皂苷。首次建立人参果提取物指纹图谱。关键词：人参果，人参皂苷，大孔吸附树脂，高速逆流色谱，指纹图谱，（），：（：），；，、，一，（，），：¨（），：；，：；，：，：，英文缩写英文缩略英文全称中文名称超临界流体萃取微波提取半仿生提取法高速逆流色谱高效液相色谱紫外光谱法红外光谱法核磁共振法质谱法气相色谱法薄层色谱高效毛细管电泳法超滤技术创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工

4、作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：翻、藏丝时间：口口年多月，一日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。（保密的学位

5、论文在解密后应遵守此协议）论文作者签名：磊、丝时间：口夕铷躲啊帆砷月日年舌月日中同农业科学院硕卜学位论文第一章绪论第一章绪论人参为五加科人参属植物人参（）的干燥根。是我国传统的名贵中药，始载神农本草经列为上品，入药已有千多年的历史。神农本草经、本草经集注、本草纲目、备急千金药方等多部古代医学著作对其药理和应用都有详尽的记述。传统医学认为人参具有“主补五脏，安精神，安魂魄，止惊悸，除邪气，明目开心益智，久服轻身延年”的药效作用。世纪年代以来中外学者对人参的药理作用进行了广泛而且深入的研究。现代药理学研究表明人参具有抗疲劳、抗应激、抗炎、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、降低血糖、提高免疫力、抑制癌细胞生长

6、、促进蛋白质和核酸合成、促进生长发育保护肝脏、提高生物膜透性等活性和提高记忆力等方面具有重要作用。人参主要分布于我国的黑龙江、吉林、辽宁三省，在国外主要分布于朝鲜半岛、日本福岛、前苏联东西伯利亚等地。人参果为人参（）系五加科人参属植物人参的成熟果实，人参果含有人参皂苷、多糖、生物碱、挥发油、氨基酸、无机元素以及甾醇等多种化学成分，其中人参皂苜是其主要化学成分，含量也最为丰富，研究表明人参果所含总皂苷为人参根含量的倍，人参皂苷含量为人参根部的倍。所以人参果是宝贵的人参皂苷资源。人参果中含有同人参根部相同的人参皂苷、等，所以其药理作用也相近。现代药理学研究表明人参果具有抑菌、降血糖、抗休克、保护心

7、肌、保护肾上腺皮质功能、提高小鼠学习和记忆能力、增强免疫功能以及延缓衰老等多种药理作用。人参皂苷进展据报道现已从人参根、茎、叶、花、果中分离出的人参皂苷有多种化合物。总皂苷称为人参皂苷，按硅胶薄层色谱值的大小顺序，由小到大命名为、。人参果皂苷为三萜皂苷，按其结构分为达玛烷型人参皂苜和齐墩果酸型人参皂苷，达玛烷型人参皂苷又分为（）一原人参二醇类人参皂苷和（）一原人参三醇类。由于人参以根部入药，所以人参果化学研究同人参根部比，研究较少，而且其色素类成分较多，因此给人参皂苷的分离带来一定困难，到目前为止从人参果中仅分离鉴定了余种人参皂苷。年李向高比较了人参不同部位所含人参总皂苷的含量。发现人参果所含

8、总皂苷为人参根含量的倍。日本学者等从人参果中分离鉴定出种人参皂苷：分别是、和，同时测定出人参果中所含人参皂苷含量高达。年赵澍从人参果中分离出种人参皂苷：、和。年开始白喜耕采用硅胶柱层析法以氯仿甲醇水和氯仿甲醇乙酸乙酯中国农业科学院硕学位论文曼曼曼皇曼曼皇曼寰！水和正丁醇乙酸乙酯水作为洗脱系统，先后从人参果中分离并鉴定了种人参皂苷：（）人参皂苷、（）人参皂苷、和。其中（）一一；一一第一章绪论曼曼人参皂苷和（）人参皂苷为其首次从人参果中分离得到的一对人参皂苷异构体。徐绥绪等于年采用大孔吸附树脂吸附得到总皂苷，然后采用低压硅胶柱层析和从人参果中分离鉴定了种人参皂苷分别是、（）、（）及，其中人参皂营和

9、为首次从人参果中分离得到。年赵余庆等采用硅胶组层析法，以不同比例氯仿甲醇作为洗脱系统，进一步从人参果中分离鉴定了（）型人参皂苷，（）型原人参三醇、（）型原人参三醇以及抗癌活性成分（）型人参皂苷。年王继彦等采用氧化铝柱层析结合硅胶柱层析，分别以正丁醇和不同比例氯仿甲醇作为洗脱系统从人参果肉中分离得到了一个新皂苷，经过鉴定为为异人参皂苷；此外还首次分离到了具有抗肿瘤活性成分的一个新的天然化合物人参皂营。年徐敏等以硅胶柱层析反相、柱色谱从人参果中分离到个化合物其中人参皂苷、人参皂苷、人参皂苷为首次在人参果中分离得到。年赵莹等通过大孔吸附树脂得到乙醇提取物，经过萃取后，利用反复硅胶柱色谱，反相柱色谱，

10、反相自人参果中分离得到个化合物其中其中人参皂营（）和人参皂苷（）为首次发现的新化合物，分别为，（）和（÷）一，（）。人参果的药理活性研究进展人参果含有人参皂苷、多糖、生物碱、挥发油、氨基酸、无机元素以及甾醇等多种化学成分，一般认为人参的主要药效成分为人参皂苷，人参果中含有与人参根部相同的人参皂苷。、的药理作用。由于分离技术的不断发展，放在单体皂苷的药理研究上。、：等，所以人参果具有同人参相似人们越来越多地把药理作用的研究重点促进学习记忆功能试验证明人参皂苷对学习记忆有明显的作用，人参皂苷。和。均是益智的有效成分，其中效果更好。人参皂苷可改善记忆全过程，仅对记忆获得和记忆再现阶段有促进

11、作用。人参皂苷等活性成分对学习记忆的促进作用是通过多种分子水平上的调节机制得以实现的。人参皂苷。和。药理作用机制研究表明，人参皂苷。和均可促进幼鼠身体发育，并简化小鼠成年后跳台法和避暗法记忆中国农业科学院硕：学位论文第一章绪论获得过程，。和。增强记忆功能等方面具有明显的促进作用。调节免疫功能人参果汁具有显著增强小鼠免疫功能的作用。主要表现在提高小鼠吞噬细胞吞噬功能和增强小鼠细胞免疫功能方面。年姚月梅等采取给小鼠连续应用人参果原汁和人参及生理盐水灌胃后，测定小鼠各项免疫指标。结果表明种不同浓度人参果汁均能明显增强小鼠外周血中性粒细胞吞噬指数、腹腔巨噬细胞吞噬指数、所致淋巴细胞转化率及外周血中性粒

12、细胞数量，与生理盐水比较差异极显著。人参果汁还可增加脾指数及外周血单核细胞数量，与生理盐水比较差异极显著，对小鼠胸腺指数无影响，与生理盐水组比较差异显著。试验结果表明人参果汁具有增强小鼠免疫功能的作用。人参皂苷具有调节人体免疫功能的作用，包括增强体内吞噬细胞的活性，刺激机体对各种抗原产生相应的抗体，促进淋巴细胞和淋巴细胞转化增殖等多种形式。年张仲苗等研究发现，能明显增加小鼠血清溶血素含量和抗体生成细胞数量，表明。能明显增强小鼠体液免疫功能。年任杰红等以鼠，大鼠为对实验对象用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、免疫器官重量及大鼠血清一、补体、的水平来评价考察了人参皂营。对老鼠免疫系统的影响，结果表明从实验

13、结果可看出，能增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能：显著增加小鼠免疫器官的重量，从而证明。可提高小鼠的非特异性免疫力。一及补体系统在免疫反应中的重要作用，可明显提高大鼠血清中的一含量及补体、含量，因此认为可提高实验动物机体免疫力，起到提高机体防御功能的作用，即有免疫促进作用。抗衰老人参果的抗衰老作用主要表现在明显提高血清、活性。研究表明可能通过改善自由基代谢发挥抗衰老作用。年冯彪等探讨了人参果饮料对大鼠过氧化脂质及细胞电泳率的影响。结果表明：给予人参果饮料的大鼠组织中过氧化脂质（）含量明显低于对照组，外周血红细胞电泳率（）及脾细胞电泳率（）明显高于对照组，说明人参果饮料有较好的抗氧化作用，认为其具有良好

14、的延缓衰老作用。年孙景礼等用人参果给老年大鼠连续灌胃，测血清含量、脑和肝组织脂褐质（）含量、皮肤和肝组织羟脯氨酸（）含量及血清、活性。结果为个剂量组均能明显降低老年大鼠血清含量及脑和肝组织含量，明显提高血清、活性及皮肤含量。抗衰老作用是通过增强物质代谢、提高抗体免疫功能、调节内分泌、抗氧化等多种作用形式来实现的。第一章绪论曼曼曼曼！曼曼曼曼曼曼曼曼曼！曼！曼！曼曼！曼！皇曼曼！曼曼！曼曼曼曼曼！曼曼！苎曼曼曼！曼曼曼皇！曼！曼曼曼曼曼曼舅皂苎曼曼曼曼曼曼曼曼曼中国农业科学院硕十学位论文保护心血管系统人参皂苷对心肌具有保护作用。这种作用通过人参皂苷提高机体抗缺氧能力，增加冠脉血流量，改善心肌营养

15、等多种功能实现。年杜葵琴试验证明，人参果皂苷有抗休克、保护心肌作用。对失血性休克犬心肌有保护作用。采用健康杂种犬只，随机均分为失血性休克组（，放血使血压降至，并在这个血压上维持）和失血性休克人参果皂苷治疗组（，放血前肌注人参果皂苷生理盐水溶液，其它处理同组）。观察失血后犬存活率及心肌超微结构和¨改变。结果表明：与组比较，组犬存活率明显提高，差异显著（）；组犬心肌超微结构病变，如肌膜、肌原纤维、肌浆网、线粒体、闰盘等细胞器损害明显减轻：组犬心肌肌浆网内增加，线粒体内减少。这些结果从不同水平上提示人参果皂苷有抗休克、保护心肌作用。年武毅等研究人参果皂苷对急性心肌梗塞犬冠脉循环及心肌氧代谢

16、的影响犬结扎左冠状动脉前降支造成急性心肌梗塞模型，同时静脉滴注进行治疗，通过记录冠状动脉血流量，测定动、静脉血氧含量，观察心肌氧代谢变化。结果：与心肌梗塞模型组比较，静脉滴注和一，可使急性心肌梗塞犬心肌血流量明显增加，冠脉血管阻力明显降低（或），并能使心肌氧利用率及心肌耗氧量明显降低（或），对心肌耗氧指数无明显影响（）本实验结果表明，在不明显增加心肌耗氧指数的同时，能明显降低心肌耗氧量及心肌氧利用率。可见，不仅通过改善冠状动脉循环，增加心肌供血，还可通过降低心肌耗氧量及心肌氧利用率，使心肌利用更少的氧作同样的功，即提高心肌工作效率，从而改善心肌氧的供求关系，使心肌细胞免于坏死。年陈玉珍等从人参

17、不同部位所提总皂苷，以相同剂量给大鼠灌胃，用异丙基肾上腺素造成心肌坏死，观察心电图、血清酶学变化以及病理变化。结果表明人参果皂苷作用明显能保护心肌，使之病损减轻。年于竹松等报道了人参果、根皂苷对家免实验性心律失常影响的对比研究，证明人参果皂苷有抑制室性早搏发生的作用。年龚建林等考察了人参果总皂苷对乳鼠原代培养心肌细胞作用的试验研究。试验结果表明：人参果总皂苷有促进乳鼠培养心肌细胞合成的作用：对缺糖缺氧培养的缺氧性损伤的心肌细胞具保护作用。年王志凯等以氯仿为诱发小鼠心律失常模型，研究人参果提取物对小白鼠心律的影响。结果表明：人参果皂苷有明显的抗心律失调作用，有效率为。年范盘生等研究了三七总皂苷和

18、人参果总皂苷在饲喂条件下对老年大鼠心脑组织脂褐质及血清过氧化脂含量的影响。三七总皂苷和人参果总皂苷（），持续月，能显著降低老年大鼠心脑组织脂褐质及血清过氧化脂含量。可升高及其亚组分的含量，增加血清比值，对和含量无明显影响。认为其抗动脉粥样硬化病变形成可能与其抗氧化作用有关。陈月等应用山参果汁总皂苷考察了对大鼠离体心脏血流动力学的影响，实验中通过处死大鼠取出心脏在离体工作心脏搏动稳定后，按给药前药后、和的顺序观察作用在给药后不同时间均可减慢，降低、中同农业科学院硕：学位论艾第一章绪论和±，与给药前比较差异有显著性，并呈现一定的剂量依赖关系：对无显著影响。人参皂苷对心血管起作用，它具有明

19、显的强心作用，能增加心肌的收缩力、减慢心率、增加心输出量和冠脉血流量。其中人参皂苷抑制，酶的活性，提高心肌细胞内钙离子浓度，增强心肌的收缩张力。人参皂苷的强心作用还可能与其促进儿茶酚胺的释放及提高心肌的比值有一定关系。人参皂苷具有扩张血管的功能，可降低总外周阻力，增加机体各组织的血流量，抑制血管收缩剂一轻色胺对血管的作用。人参皂苷对血管的扩张作用是非选择性的，而。选择性地对抗钙离子引起的血管收缩，有关人参扩张血管的机理尚待进一步研究。前认为这种机制可能与人参皂苷抑制细胞膜与钙离子的结合作用有着某种联系。尽管人参对血管具有扩张功能，但人参与血压之间的关系则较为复杂，个体因素、皂苷种类、剂量大小等

20、多种因素都会影响人参对血压的作用。人参皂苷有利于维持心血管系统的正常生理功能，能有效预防多种因素造成的休克，明显改善冠心病、心率失常的症状，减少心肌梗塞的死亡率。对心力衰竭、肺心病、动脉硬化等心血管疾病也有一定的作用。抗心血管疾病的功能与它强心作用、扩血管、改善微循环作用以及抗缺氧、抗心肌缺血再灌注损伤、抑制血小板聚集、降血脂、抗血栓形成等生理功能密切相关。抗肿瘤人参皂苷对肥大细胞瘤、白血病、骨肉瘤、恶性淋巴瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤畸胎瘤、甲状腺癌、直肠癌、肺癌、肝癌、食道癌、胆管癌、乳腺癌、胃癌、宫颈腺癌、卵巢癌等肿瘤的生长均具有明显的抑制作用，可显著减少肿瘤数目，缩小瘤体，诱导肿瘤细胞调亡

21、、分化以及抑制肿瘤细胞的转移、扩散等。抗肿瘤活性受构效影响较大，规律如下：（）抗肿瘤活性受母核影响，其强弱规律是：齐墩果酸型原人参二醇型原人参三醇型；（）抗肿瘤活性受糖影响强弱规律是：苷元单糖苷二糖苷糖苷四糖苜；（）抗肿瘤活性受构型影响的强弱规律是：（）一人参皂苷（）一人参皂苷。此外还发现人参皂苷抑制癌细胞增殖作用的能力最强，。次之，浓度为卜的：对黑色素瘤细胞即可产生抑制作用，一则可以抑制肝癌细胞增殖。人参皂苷和肿瘤坏死因子（）在小鼠实验性肿瘤的治疗上有明显的协同作用。人参皂甙。具有抗肿瘤转移的作用。人参皂甙的抗肿瘤转移机理可能与其促进一氧化氮生成、抑制肿瘤细胞对细胞外基质的黏附、抑制肿瘤新生

22、血管生成、降低细胞内浓度等有关。年高勇等研究了人参皂苷。对肿瘤新生血管的抑制作用，发现在体外。对鸡胚尿囊膜（）血管形成具有明显的抑制作用，且当。浓度为时，对血管的抑制作用接近：在体内对荷瘤肺癌小鼠新生血管形成有明显抑制作用，且此抑制作用随剂量增加而增强。利用免疫组中国农业科学院硕：学位论文第一章绪论化研究还证实。可下调肺癌小鼠模型中肿瘤细胞产生碱性成纤维细胞生长因子（）的水平，推测对肿瘤新生血管形成的抑制作用可能是通过。抑制肿瘤细胞产生而发挥的。年潘子民等采用、酶联免疫吸附法和免疫组织化学法检测荷卵巢癌的严重联合免疫缺陷（）鼠腹腔移植瘤模型的血管内皮生长因子（）蛋白及微血管密度（），结果发现经

23、处理后，荷瘤，鼠体内无腹水形成，腹腔中肿块播散较少。实验组肿瘤组织中表达量、蛋白的表达量和显著低于空白组、对照组，从而认为。通过下调肿瘤及蛋白的表达量，阻滞肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤的生长。降血糖作用芝加哥大学袁春舒等人发现以基因缺陷型型糖尿病老鼠为研究对象，从人参果中提取出提取物，每天注射两次每天注射，天后发现血糖水平从降低到，效果非常明显，同时还发现人参果提取物还具有很明显的减肥作用，注射人参果体重有明显的降低，停止注射后体重又恢复到原来的水平。等人发现人参皂苷：具有非常明显的降糖活性，的人参皂苷盐水腹腔注射对大鼠具有明显的降血糖作用，血糖含量在注射后比对照组下降了。他们进一步观察人参皂菅

24、。对试验性链霉佐菌素糖尿病大鼠的降血糖活性，腹腔注射人参皂苷后，人参皂苷组大鼠的血糖含量较对照组下降了，肝糖原则增加。人参皂苷的降血糖作用是通过抑制肝脏一一磷酸酶活性，同时增强葡萄糖激酶的活性使糖酵解途径得以顺利进行。进一步研究发现，人参皂苷对链霉佐菌素糖尿病大鼠的高脂血症也有改善作用。糖尿病的特点是血糖高和并发症影响眼睛、肾脏、神经，血管，等人发现对链霉佐菌素糖尿病大鼠有很强的降低血糖、总胆固醇和甘油三脂作用，另外具有很强的抗氧化活性保护肾脏和眼睛，降低糖尿病引起的并发症。本文研究的意义人参皂营是人参根、茎、叶、花、果中的主要化学成分，现代药理学的研究发现人参皂苷具有抗疲劳、抗应激、抗炎、抗

25、肿瘤、抗衰老、抗辐射、降低血糖等多种显著的药理药理作用，医药、食品等行业对其需求量越来越大，同时人参皂苷、。、。也被中华人民共和国药典规定为人参及其制品的质量标准控制目标成分。目前人参皂苷的全合成限于技术限制不能形成工厂化生产，仅能从人参属植物人参、西洋参，三七的根、茎、花、果中提取分离。所以资源十分有限。通过研究发现人参果中皂苷含量丰富，可以作为获得人参皂苷的资源，极具开发价值。人参根部可以入药，茎叶可以作为提取人参皂苷的原料，人参果在生产中取籽后，富含人参皂苷的果渣部分同废水一同排掉。本次研究可以为人参果高效利用奠定理论和方法学基础。中图农科学院硕士学位论文第一章绪论通过研究筛选出了适宜于

26、人参果皂苷提取的大孔吸附树脂，建立了人参果皂苷大孔吸附树脂分离工艺，为人参果皂苷的工业化生产奠定了基础。建立了高速逆流色谱法分离人参果中人参皂苷分离工艺，可以实现人参果中人参皂苷的快速分离，得到高纯度人参皂苷单体化合物。建立了中压柱层析分离人参果中人参皂苷分离工艺，可以实现人参果中皂苷的快速分离，得到高纯度人参皂苷单体化合物，通过试验参数的放大可以实现人参果单体皂苷工厂化分离。中困农业科学院硕上学位论文第二：章制备人参皂苷第二章制备人参皂苷高速逆流色谱（，简称），分离技术是世纪年代发展起来的一种连续高效的液一液分配色谱分离技术，一相作为流动相，一相作为固定相，它不用任何固态的支撑物或载体因而避

27、免了样品的损失、失活、变性。自教授研制出高速逆流色谱仪以来，技术以其适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。广泛应用于天然产物化学、生物化学、生物工程、医学、药学、化工、有机合成、农业、食品等领域。具有以下优点：（）应用范围广，适应性好。可以适用于任何极性范围样品的分离。所以在分离天然化合物方面具有其独到之处。（）回收率高。由于该色谱技术没有固定载体，不存在吸附和降解，理论上只要调整好分离条件，样品的回收率可达。（）重现性好，如果样品不具有较强的表面活性作用，酸碱性也不强，那么多次进样，其分离过程都会保持很稳定，保留时间相对标准偏差小于，而且重现性好。（）分离效率高、分离量大

28、、能实现连续分离。可采用多种多样的溶剂系统，实现从微克分析到数克的制备提纯。与相比，进样量大，甚至可从粗提物一步纯化到纯品。（）成本低。分离技术只需选用分析纯试剂，而不需价格较高的固相柱填料及色谱纯试剂。随着天然产物产业的发展，高速逆流色谱已成功应用在天然产物分离制备方面，已用于生物碱、黄酮类、萜类、木脂素、香豆素、皂营类等有效成分的分离制备中。本研究首次采用此技术制备分离人参果中人参皂苷，为人参果中人参皂营的分离制备提供了新的技术方法。试验材料与仪器试剂人参皂苷对照品甲醇（分析纯）氯仿（分析纯）正丁醇（分析纯）乙酸乙酯（分析纯）正己烷（分析纯）乙腈（色谱醇）中国药品生物制品检定天津市标准科技

29、有限公司天津大茂化学试剂厂天津大茂化学试剂厂天津大茂化学试剂厂天津大茂化学试剂厂天津协和吴鹏色谱科技有限公司仪器高效液相色谱系统（日本岛津）：岛津色谱仪，在线脱气机、二元梯度泵、级管阵列检测器、自动进样器、色谱工作站、系统控制器、柱温箱。中国农业科学院硕：学位论丈第二章制备人参皂苷高速逆流色谱仪液相泵大连江申分离科学技术公司紫外检测仪北京市新技术应用研究所便携式记录仪四川仪表厂部分收集器超声清洗器江苏张家港市超声波仪器厂电子天平大型旋转蒸发仪德国小型旋转蒸发仪瑞士薄层观察分析仪长沙克罗玛医药科技有限公司型超纯水器不锈钢电热蒸馏水器上海东星建材试验设备有限公司材料试验用人参果年月采自吉林省抚松县

30、，经中国农业科学院特产研究所侯一兵副研究员现场鉴定为人参（）的果实。实验部分样品预处理人参果取籽后的果渣公斤用乙醇溶液浸泡过夜，超声提取，反复提取三次，提取液过滤后浓缩得人参果粗浸膏。将粗人参果粗浸膏溶于蒸馏水中，移入分液漏斗中，加入正丁醇萃取，反复萃取次，合并正丁醇溶液浓缩得浸膏。溶剂系统筛选采用薄层色谱法对高速逆流色谱溶剂系统分配系数的测定值为依据，对文献中记载的的氯仿一甲醇一正丁醇一水、正己烷一正丁醇一水、乙酸乙酯一正丁醇一水进行溶剂系统的筛选，结果见表。实验结果表明：乙酸乙酯一正丁醇一水（：下相）为最佳溶剂系统，固定相保留率，分配系数。按下列公式计算：固定相保留（柱外流通管的死体积一管

31、柱中推出的流动相体积）管柱总体积分配系数溶质在固定相中的浓度溶质在流动相中的浓度中困农、眦科学院硕卜学位论文第章制各人参鬯苷表溶剂系统筛选结果有效成分分离溶剂系统的配制乙酸乙酯一正丁醇一水（：）比例配制溶液，置于分液漏斗中摇匀，放置过夜静置分层。样品制备取浸膏用：上下相溶解。转速和流速的筛选逆流色谱的分离原理是固定相靠重力场分布在管中，一般来说转速高理论踏板数高，分离度就高，所以转速和流速对分离度有很大的影响，在高流速时，分离度会随流动相流速的提高而提高，随转速的提高而提高，达到最佳点之后开始下降；在低流速时则相反。本研究选择了转速为研究对比了转速、流速、，分别进行了多次试验最后选定了转速，同

32、样流速太慢增加了分离时间，实验试剂消耗大，流速太快可以将固定相带出，分离度降低，经过比较、，最佳流速为。温度对分离效果的影响逆流色谱分离原理是样品在两相溶裁分配比例不同实现的，对两相溶剂来说，两相之间的相互溶解度随着温度的升高而升高，而溶液的黏度随温度的升高而降中同农、科学院硕士学位论文第一二章制备人参皂苷低，这些变化会对固定相保留值和分离效率造成影响。这种温度变化对非水相两相溶剂体系的影响较大，对含水的溶剂体系，在等梯度洗脱下，温度的变化对分离重现性的影响不大。但是，对线性或梯度洗脱的重现性的影响较大。本试验是含水相的等度洗脱，所以温度对其分离效果不会有太大影响，因此本方法适用范围较广。高速

33、逆流色谱分离将固定相（上相）由首端向尾端注入管路中，主机转速设定为，然后以的流速泵入流动相（下相），待流动相流出两相溶荆在柱中达到平衡状态时（同时测定保留率），通过进样阀注入样品溶液，进样量。检测紫外检测、紫外检测器在检测，吸光值升高开始收集流份，每分钟收集试管。母加加仲（）图人参果正丁醇萃取物高速逆流色谱色谱图薄层色谱检测每隔管对分离出的组分进行薄层检测，以氯仿一甲醇一水（：）下层作为展开剂，硫酸乙醇溶液显色，合并值相同点的流份溶液。目镕目目结晶重结晶山试许溶液舟计后的浓缩后，睁溶解，经反复结品虽终得到人参皂廿单体纯协。高效液相色谱检测标准溶液的配置精确称取人参盱对麒品，加阵溶解，定容垒，配

34、制成浓度向的人参皂叶对照溶液。样品溶液的配置取站，醇溶解，定徉至。，取人奎果止醇苹啦浸舟甲醇溶解，定齐至色谱条件色谱托：，（×）：流动相，乙腈。水，检测。波；流速：温进样越圳川检测将样估溶液川微孔滤膜过滤，进样，得剑色谱耋如图，远刚色谱】作站进行对峰面积积分，遥面积归化法测定样品中含量。为中国农业科学院硕十学位论文第二章制符人参皂苷味皤图人参皂苷对照品的色谱图静图翩备的人参皂苷的色谱图。一：卅图人参皂苷对照品的光谱图（）（）蛐：蛳“、图制备的人参皂苷的光谱图（）（）中回农业科学院颀学位论文第章制备人参皂苷伽图人参果正丁醇萃取物的色谱图结果样品峰与对照品人参皂苷的保留时间均为，且其紫外

35、光谱图相同，可以确定结晶为人参皂苷（如图），通过对照品人参皂苷峰面积运用归一化法比较，计算出人参皂苷纯度为。实验结果表明以乙酸乙酯一正丁醇一水（：）作为分离系统分离制备人参果中人参皂苷效果最佳。人参皂苷分离时间为，固定相保留率。讨论人参果中化学成分复杂，尤其是色素含量较多，严重制约了其单体化合物的分离，在硅胶层析和制各液相色谱分离时首先要除掉色素否则影响分离的结果，而此次运用高速逆流色谱法分离人参果中人参皂苷在很好的将色素除去，减少了分离步骤。实验中对氯仿一甲醇一正丁醇一水、正己烷一正丁醇一水、乙酸乙酯一正丁醇一水进行溶剂系统的筛选，优选出了适用于人参果中分离人参皂苷最佳溶剂系统乙酸乙酯一正丁

36、醇一水（：）。本研究采用法分离制备人参果中人参皂苷纯度可达到，且分离成本低，纯度高。实验结果明，法可应用于人参果中人参皂苷的分离制备。中国农业科学院硕学位论文第二三章大孔吸附树脂分离研究第三章大孑吸附树脂分离研究大孔吸附树脂是世纪年代发展起来的一类有机高聚吸附剂，其原料多为苯乙烯或一甲基丙烯，显微形状为球形颗粒，内部具有三维空间立体孔结构，颗粒内部有许多网状孔穴而具有很大的比表面积，具有良好的吸附性能，既能通过表面作用和形成氢键产生作用，同时网孔作用又具有良好的筛选作用，其空的结构、孔径、空体积、空的面积和含有官能团的性质及官能团数目的多少等是影响大孔吸附树脂性能的关键因素。按大孔吸附树脂的化

37、学结构特点和易吸附分离的化学物质的性质，可将大孔吸附树脂分为以下四类。（）非极性大孔吸附树脂。通常指在分子当中电荷分布均匀，在分子水平上不存在正负电荷相对集中的极性基团的树脂。（）中极性大孔吸附树脂。该类树脂中存在酯基（一）一类的极性基团，使整个分子具有一定的极性。（）极性大孔吸附树脂。在该类树脂中存在一些极性较大的基团，如酰胺基（）、亚砜基（）、腈基等基团。（）强极性大孔吸附树脂。该类树脂中存在一些极性和大的基团，如吡啶基（一）、氨基（）等。目前大孔吸附树脂技术在中药化学中得到了广泛的应用，己成功已应用于皂苷、生物碱、黄酮、多肽、糖类化学成分的富集、分离。大孔吸附树脂对天然药物中大多数有效成分吸附，而对水溶性成份如单糖、低聚糖、小分子有机