血清浓度对脂肪成体干细胞向软骨细胞分化的影响△

1、血清浓度对脂肪成体干细胞向软骨细胞分化的影响        【摘要】     目的比较不同浓度的血清，在转化生长因子1（TGF1）存在的条件下，对脂肪成体干细胞（adiposederived adult stem cells，ADASCs）向软骨细胞分化的影响，探讨较为合适的血清浓度。方法取成年新西兰兔颈部脂肪组织，剪碎后通过型胶原酶消化，得到脂肪成体干细胞；稳定传代后，分别用含1FBS和10FBS的软骨诱导液干预ADASCs 2周，采用MTT检测方法对细胞增殖活性

2、进行比较，应用甲苯胺蓝染色及型胶原免疫组化染色进行软骨细胞鉴定，利用Leica病理图像软件分析两组间型胶原免疫组化染色后的灰度，比较两组细胞分化的效果。结果MTT检测显示10FBS组细胞增殖活性高于1FBS组（P0.05），两组细胞的甲苯胺蓝染色及型胶原免疫组化染色均为阳性，并以10FBS组更为显著；灰度分析提示10FBS组型胶原表达量高于1FBS组（P0.05）。结论体外研究表明，含10FBS的软骨诱导液更有利于脂肪成体干细胞向软骨细胞方向增殖和分化，这将为作者采用这种新型的干细胞修复软骨缺损做好前期的准备。     【关键词】  脂肪成体干

3、细胞； 血清浓度； 软骨细胞    关节软骨损伤后的修复和重建是骨科面临的难题之一，迄今尚未得到很好的解决。传统的治疗方法如软骨下钻孔、磨削、微骨折等均存在一定的缺陷，但软骨组织工程技术的发展为解决这一难题带来了新的契机。组织工程中，种子细胞的来源是其首要和基本因素。常用的种子细胞是未分化的前体细胞或称为干细胞。最近，一种新的干细胞脂肪成体干细胞（adiposederived adult stem cells，ADASCs）已被人们从脂肪组织中提取出来。研究证明，脂肪成体干细胞具有体外扩增能力强、衰老较缓慢及多向分化的潜能16。目前对于脂肪成体干细胞向成

4、骨细胞分化的研究较多，但是向软骨细胞分化的研究则相对较少。其原因在于脂肪成体干细胞向软骨细胞分化中存在许多不确定的因素，包括TGF1、血清、胰岛素等的浓度以及诱导培养的方法等。为此，作者在前期研究即TGF1为10 ngml的基础上7，探讨血清浓度对脂肪成体干细胞向软骨细胞增殖分化的影响，从而为这种新型干细胞更好修复软骨缺损的深入一步研究提供实验依据和参考。    1  材料与方法2  结果    2.1  脂肪成体干细胞形态学观察    原代培养的细胞于24 h内贴壁，贴壁细

5、胞胞浆突起，初期为短梭形或小多角形，单核，细胞体积较小，呈集落或分散生长，以后细胞逐渐变为长梭形或多角形，呈类成纤维细胞样；贴壁后的细胞增殖速度较快，多个集落互相连接并逐渐融合，7 d左右可长满瓶底。传代后细胞突起减少，多呈长梭形或三角形，漩涡状生长，45 d可长满（图1）。    2.2  细胞增殖活性    MTT比色法显示在诱导后第3、7、14 d，10%FBS组OD值均显著高于1% FBS组（P0.05），表明10% FBS组的细胞具有较好的增殖活性（图2）。    2.3 

6、甲苯胺蓝染色    两组细胞甲苯胺蓝染色均呈阳性，10% FBS组的阳性染色程度较高（图3）。    2.4  型胶原免疫组化染色    型胶原免疫组化染色见两组细胞外基质的型胶原表达均呈棕黄色阳性（图4）。    2.5  型胶原灰度值分析结果    Leica病理成像系统分析两组细胞型胶原免疫组化染色后的灰度值结果见表1所示。采用SPSS 13.0软件行两样本t检验，提示两组间有显著性差异（t=-13.306,P0.05）

7、。表1  2组细胞型胶原灰度值分析结果（略）3  讨论    组织工程软骨构建的首要条件是能获得足够数量的种子细胞，理想的种子细胞应具有易扩增、无免疫排斥及向所替代组织分化的潜能。由于成熟的软骨细胞来源有限，体外增殖能力弱，且表型稳定性差，难以满足组织构建的需要。因此，干细胞成为组织工程研究的热点。干细胞按照来源分为胚胎干细胞和成体干细胞，两者均有强大的自我更新能力及多向分化潜能，但胚胎干细胞由于涉及伦理道德问题使其应用受到限制。因此，成体干细胞是目前组织工程中最重要的种子细胞来源。长期以来，骨髓间充质干细胞（bone marrow strom

8、al cells，BMSCs）一直是组织工程研究中首选的种子细胞。然而，BMSCs在应用过程中也发现一些问题8，学者们为了更好的研究种子细胞，在多方面进行了更广泛的探索。    新近发现的脂肪成体干细胞（ADASCs）是一种来源于脂肪组织的间充质干细胞，目前的研究已证实其具有与BMSCs类似的多向分化潜能。与BMSCs相比，ADASCs组织来源数量更为充足，少量的脂肪组织便可获取大量的成体干细胞，并不会因为年龄的增加而导致脂肪组织中干细胞数目的减少9，且其培养条件更为简单，分化表型可长期维持，衰老较为缓慢。同时，抽吸脂肪对患者的损伤较小，与抽取骨髓相比，患者更易接

9、受。因此，ADASCs是一种很有应用前景的组织工程种子细胞。    干细胞向特定细胞分化的过程中，要经历增殖和分化两个阶段。一般认为，这两个阶段是一个动态平衡的过程。细胞在分化的过程中，其增殖的速度将逐渐减慢，因此良好的增殖将有利于更多的干细胞向所需要的细胞分化。TGF1具有促进原始的间充质细胞向软骨细胞分化的作用10，它对细胞的增殖作用较小。作为细胞培养中常用的添加成分，血清的重要性是不言而喻的。研究已经证明，血清浓度不仅可以影响细胞的分化11，而且对细胞的增殖也具有重要的意义。由于血清中的复杂成分至今尚未完全清楚，其中不仅存在促细胞生长因子，同时也存在细胞生长

10、抑制因子，故而合适的血清浓度对于体外培养细胞的增殖和分化是非常重要的。因此，本实验对比了在TGF1为10 ngml的情况下，血清浓度对脂肪成体干细胞向软骨细胞分化的影响。通过作者的实验研究可以看出，MTT检测结果显示10血清较1血清更能促进细胞的增殖，甲苯胺蓝染色及型胶原免疫组化染色灰度分析则表明10血清具有更好的促进ADASCs向软骨细胞分化的作用。因此，作者认为含10浓度胎牛血清的软骨诱导液对于ADASCs的增殖和分化效果更好。由于不同来源、不同批次的血清质量变化较大，可能会造成实验结果的数值不尽相同，本研究的目的是为了说明血清浓度在诱导细胞增殖和分化两方面的影响，在此基础上，作者将进一步

11、探讨其他可能影响ADASCs向软骨细胞增殖、分化的因素，提供使用这种新型干细胞作为种子细胞的较成熟的经验。    （本文附图见加页4）（略）       【参考文献】  1 Zuk PA,Zhu M,Ashjian P,et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cellsJ.Mol Biol Cell,2002,13:42794295.2 Erickson GR,Gimble JM,Franklin DM,et

12、 al.Chondrogenic potential of adipose tissue derived stromal cells in vitro and in vivoJ.Biochemical and Biophysical Research Communications,2002,290:763769.3 Safford KM,Hicok KC,Safford SD,et al.Neurogenic differentiation of murine and human adiposederived stromal cellsJ.Biochem Biophys Res Commun,

13、2002,294:371379.4 Choi YS,Cha SM,Lee YY,et al.Adipogenic differentiation of adipose tissue derived adult stem cells in nude mouseJ.Biochemical and Biophysical Research Communications,2006,345（2）:631637.5 Mizuno H,Zuk PA,M Zhu,et al.Myogenic differentiation by human processed lipoaspirate cellsJ.Plas

14、t Reconstr Surg,2002,109:199211.6 Cousin B,Andre M,Arnaud E,et al.Reconstitution of lethally irradiated mice by cells isolated from adipose tissueJ.Biochem Biophys Res Commum,2003,301:10161022.7魏义勇，胡蕴玉，郝伟，等.重组人骨形成蛋白2诱导脂肪成体干细胞向软骨分化的形态学研究J.中国修复重建外科杂志，2006，20（8）：845848.8 Guall Im,shin YW,Lee KB.Do adip

15、ose tssuederived mesenchymal stem cells have the same osteogenic and chondrogenic potential as bone marrowderived cellsJ.Osteoarthritis and Cartilage,2005,13(10）:845853.9 Morizono K,De Ugarte DA,Zhu M,et al.Multilineage cells from adipose tissue as gene delivery vehiclesJ.Hum Gene Ther,2003,14（1）:5966.10 Zhou S,Eid K,Glowacki J.Cooperation between TGFb