RT-qPCRformiRNA

1、2016RT-qPCR for miRNAmiRNA简介简介 microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链个核苷酸的非编码单链RNA分子分子,它们在动植物中参与转录后基它们在动植物中参与转录后基因表达调控。目前检测基因表达最灵敏、可靠的方法是实时定因表达调控。目前检测基因表达最灵敏、可靠的方法是实时定量量 PCR （ realtime quantitative PCR ， qPCR ），但常），但常规的规的 qPCR 无法扩增只有无法扩增只有 1825 nt 的的 miRNA 分子，将分子，将 qPCR 方法用于检测方法用

2、于检测 miRNA 需要特殊的设计或对样品特别处需要特殊的设计或对样品特别处理。通常用的有：理。通常用的有： l 加尾法定量加尾法定量PCR(QIAGEN)l 茎环法定量茎环法定量PCR(RIBO) miRNA形成过程形成过程加尾法原理加尾法原理茎环法原理茎环法原理 加尾法加尾法 茎环法茎环法逆转录逆转录一次逆转录得到全部miRNA、pre-miRNA和mRNA的cDNA，操作简单，但是没有选择性特异的茎环结构逆转录引物，每条miRNA单独逆转录，特异性好，但是成本更高，工作繁琐PCR特异性特异性检测mature miRNA的同时，也会检测到pre-miRNA特异性检测mature miRNA

3、，可以避开pre-miRNA两种方法的应用比较两种方法的应用比较实时定量实时定量PCR技术：技术：利用荧光信号的变化荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规与常规 PCR技术比较：技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量荧光定量PCRPCR原理定义原理定义常用荧光定量标记方法常用荧光定量标记方法l 非特异性荧光标记l SYBR Green Il 特异性荧光标记l TaqMan ProbeSYBR Green I是一种结合于所有dsDN

4、A双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。与DNA结合时发光，游离时不发光。SYBR Green I 染料法染料法原理原理SYBR Green I 染料法染料法原理原理每形成一个每形成一个DNA分子，分子，就有一定数量的染料结就有一定数量的染料结合上去，染料一结合就合上去，染料一结合就产生荧光信号，信号强产生荧光信号，信号强度与度与DNA分子总数目成分子总数目成正比。正比。Taqman 探针法探针法原理原理l 55端标记有报告基团端标记有报告基团(Reporter, R) (Reporter, R) ，如，如FAMFAM、VICVIC等等 l 33端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)(Quencher, Q)引物之间的一段寡核苷酸，称为探针引物之间的一段寡核苷酸，称为探针l Taq Taq酶有酶有 5353 外切核酸酶活性，可外切核酸酶活性，可 水解探针水解探针l 探针完整，探针完整，R R发射的荧发射的荧光能量被光能量被Q Q基团吸收基团吸收 ，无荧光，无荧光， R R与与Q Q分开，分开，发荧光发荧光Taqman 探针法探针法原理原理 SYBR Green I TaqMan优点优点适用性广