紫外荧光微孔板酶检测技术测定土壤酶活性

1、紫外-荧光微孔板酶检测技术测定土壤酶活性作者：杨金燕，田丽燕，李廷强 时间：2011-12-27摘要：采用一种新的土壤酶检测技术-荧光微孔板酶检测技术，测定土壤硫酸酯酶、磷酸 酶、ß-葡萄糖苷酶和肽酶活性，采用紫外微孔板酶检测技术测定多酚氧化酶和过氧化物酶活性。结果表明，紫外-荧光微孔板酶检测技术可快速测定土壤中酶的活性。采自农田的昔 格达土的硫酸酯酶、磷酸酶和肽酶活性高于紫色土和采自矿山的昔格达土的相应的酶活性；矿山昔格达土的多酚氧化酶和过氧化物酶活性在三者中最高；紫色土的-葡萄糖苷酶活性高于昔格达土的-葡萄糖苷酶活性。关键词：土壤，酶，荧光微孔板酶检测技术，紫外微孔板酶检测技术0

2、 引言土壤中酶是植物、动物、微生物活动的产物，它与土壤微生物共同推动土壤的代谢过程。 由于土壤酶参与土壤中许多重要的生物化学反应过程，参与土壤有机物质的分解转化，且与 C、N、S、P等各元素的生物循环密切相关，因而常被作为评价土壤肥力的重要指标之一1-4。影响土壤酶活性的因素错综复杂，土壤微生物种类、水气热状况、酸碱度、结构组成、 养分丰缺、污染程度及施肥方式等都显著地影响着土壤酶活性。研究土壤酶活性与土壤理化 性质、水热状况及其它性质的关系，对于探讨土壤酶在生态系统中的作用和地位具有重要意 义5。土壤酶检测技术的创新是土壤酶学得以发展的前提和基础。20 世纪 50 年代以后，滴定 法、比色法

3、等广泛用于土壤酶的测定。近年来，由于生物化学和分子生物技术的飞速发展，土壤酶的检测技术也取得了长足的进展。荧光微孔板酶检测技术逐渐被国外研究者广泛用来研究土壤酶多样性及其功能多样性6,7，但国内应用此方法对土壤酶的研究鲜见报道。本文 选择了与土壤 C、N、P、S 等循环密切相关的几种酶，利用荧光微孔板酶检测技术测定了紫 色土和昔格达土的硫酸酯酶、磷酸酶、 -葡萄糖苷酶和肽酶活性；利用紫外微孔板酶检测 技术测定了多酚氧化酶和过氧化氢酶活性，以期为不同类型的土壤进行环境质量评价、建立 土壤生物安全预警系统提供技术方法和科学依据。1 试验材料与方法1.1 供试土壤供试土壤为昔格达土和紫色土，其中昔格

4、达土分别采自四川省攀枝花朱家包包未受污染 农田（农田昔格达土），和四川省攀枝花朱家包包采矿区的受重金属污染的土壤（矿区昔格 达土）；紫色土采自贵州省茅台镇，土地利用方式为闲置地。采样时，先去除表层有机物残 体，蛇形法取020 cm耕层土样，每个样点采集土壤0.51.0 kg，混合均匀后按四分法获取 足量样品装入无菌聚乙烯塑料袋中。将土样混匀风干，过2 mm尼龙筛后备用。常规方法测 定土壤理化性质，土壤水分采用烘干法测定，土壤 pH值采用电位法测定，土壤阳离子交换 量采用乙酸钠-火焰光度法测定，土壤有机质采用高温外加热重铬酸钾氧化容量法测定， 土壤总磷采用酸溶-钼锑抗比色法测定，有效磷采用碳酸氢

5、钠法测定，水解性氮采用碱解扩 散法测定8。土壤金属全量采用X射线荧光光谱仪（尼通XL3t 600）测定。土壤氧化还原电 位采用FJA-5型氧化还原电位仪测定（Pt电极-Ag0/AgCl参比电极，中国科学院南京土壤研究 所）。表1 供试土壤基本理化性质Table 1 Physical and chemical characteristics of tested soils土壤类型pHCEC(cmol/kg)全磷 （%）有效磷(mg/kg)水解性氮(mg/kg)有机质(%)紫色土8.0714.870.02012.45132.412.68农田昔格达土7.9510.530.0233.8433.601.

6、36矿山昔格达土8.3615.760.0723.9831.731.15表2 供试土壤金属全量土Al (%)7.41Ca (%)2.30K (%)1.97Mg (%)0.85S (µg/g)77.6Fe (%)4.31Cu (µg/g)25.4Zn (µg/g)84.3Ni(µg/g)39.4昔格达土5.900.841.841.0621.24.6026.874.147.8昔格达土3.173.880.453.425.116.06420.6161.4927.9As (µg/g)Cd (µg/g)Cr (µg/g)Co (µ

7、;g/g)Mn (%)Pb (µg/g)Sr (µg/g)V (µg/g)Ti(%)土9.22.289.934.50.04831.7103.3118.60.40昔格达土8.00.4173.230.90.07822.6111.0156.50.55昔格达土3.61.1957.8189.00.10917.8336.2632.02.67Table 2 Total contents of metals in tested soils1.2 试验方法目前，对进行酶活性测定的土壤样品的保存方法没有统一标准，可采用-20冷冻保存、4冷藏保鲜及风干处理。由于传统的比色法灵敏度低，国

8、内采用较多的为4冷藏保鲜供试土壤样品。无论哪种方法都不可避免对土壤微生物的群落结构产生影响，从而影响土壤酶活 性的测定结果。选择哪种方法取决于样品采集地的气候特征、土壤类型、实验操作的可行性 等。风干处理由于方法简单、结果稳定等原因一直被部分研究者及监测部门所采用。本试验 由于土壤采集于不同地区且距实验室较远，同时由于试验所采用的紫外-荧光微孔板酶检测 技术具有灵敏度高、重现性好的特点，因而采用风干土进行土壤酶活性的测定。土壤悬液的制备：应用四分法取风干土10 g，全部磨细过100 目尼龙筛，称取相当于1.0000 g烘干土重的风干土，置于250 ml灭菌三角瓶中，加入灭菌并冷却的醋酸缓冲液1

9、25 ml，于磁力搅拌器上均质10 min，用去尖端的移液枪提取土壤溶液。采用荧光微孔板酶检测技术测定土壤硫酸酯酶、磷酸酶、ß-葡萄糖苷酶活性及肽酶，所 用 基 质 依 次 为 200 M 的 4-MUB sulfate 、 4-MUB phosphate 、 L-leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride、4-MUB-ß-D-glucopyranoside，方法采用改 进的 Marx 等（2001）荧光 96 孔微孔板测试技术7。所有样品做 4 次重复，标准和空白做 3 次重复。标准溶液采用 0，2.5，5，10，25，5

10、0，100 M 的 4-methylumbelliferone。所用试 剂均购自 Sigma-Aldrich Co. Ltd 公司，用无菌水配置。用多功能微孔板读数仪（BioTek，美 国）测定每个孔中的荧光值，激活和发射波长分别采用 365 和 450 nm。样品酶活性用每小 时每克样品的基质（nmol）转化率表示。由于土壤多酚氧化酶和过氧化氢酶在土壤有机质转化中具有重要作用，本文对土壤多酚 氧化酶和过氧化氢酶活性也进行了测定。基质采用5 mM的L-3, 4-dihydroxyphenylalanine（L-DOPA, Sigma- Aldrich Co. Ltd, Dorse），测定方法采

11、用改进的Williams et al. （2000）的 紫外分光光度计法9。其中，测定过氧化氢酶活性的所有样品和空白均加0.1 ml 的0.3%的 H2O2。所有样品做4次重复，标准和空白做3次重复。用多功能微孔板读数仪（BioTek，美国）在460 nm条件下测定每个孔中的吸光值。样品酶活性用每小时每克样品的基质（mol）转化率表示。1.3 数据分析方法实验数据采用 EXCEL 和 SPSS 17.0 统计软件分析各样点间的差异性及变量间的相关性。2 结果分析与讨论2.1 硫酸酯酶硫酸酯酶是参与土壤和植物硫循环的重要酶类。在富含腐殖质的土壤中，绝大部分的硫 是以硫酸酯(有机硫化合物)的形态存

12、在。在硫基水解酶的作用下，有机硫化合物被矿化，并 转变为植物能吸收的无机形态。供试土壤的硫酸酯酶活性差异显著，农田昔格达土的硫酸酯 酶活性为288.33±28.79 nmol/h·g，随之是紫色土的硫酸酯酶活性为129.57±15.52 nmol/h·g， 矿山昔格达土的硫酸酯酶活性几乎为零（图1-1）。紫色土的硫含量为77.6 mg kg-1，显著高 于农田昔格达土的硫含量（21.2 mg kg-1），而较高含量的硫可能会对土壤硫酸酯酶的活性 产生抑制。而矿山昔格达土由于多种金属含量较高，且采集地没有植物生长，可能是土壤硫 酸酯酶活性低的主要原因。2.

13、2 磷酸酶土壤磷酸酶是一种水解性酶，其酶促作用能够加速磷酸单酯和无机磷的脱磷速度，从而 提高土壤磷的有效性。由图1-2可知，不同类型土壤的磷酸酶活性存在一定的差异。其中农 田昔格达土的磷酸酶活性为6624.70±1648.04 nmol/h·g，明显高于矿山采集的昔格达土和紫 色土的磷酸酶活性。而矿山昔格达土和紫色土磷酸酶活性差异不显著，其活性分别为1349.75±252.41 nmol/h·g 和1932.87±783.76 nmol/h·g（图1-2）。磷酸酶主要来源于植物、微生物 及动物，其中以植物的贡献尤其突出。而农田昔格达土

14、可能由于土地利用方式的原因，土壤 中植物残体较多，促进了土壤磷酸酶的活性。2.3 肽酶在进入土壤的植物残体和微生物体的组分中，含有大量的蛋白质、氨基酸和其它的含氮 有机化合物。存在于土壤中的蛋白酶，对这些化合物的转化起着巨大的作用。肽酶就是一种 蛋白酶，它能把多肽和二肽分解成氨基酸并析出氨，使其所含的氮元素转化为高等植物可以 利用的形式。因此肽酶通过制约氮元素的动态流动，对土壤生命起着重要的作用。通过对供 试土壤肽酶活性的测定可知（图 1-3），农田昔格达土的肽酶活性为 34456.94±5349.75 nmol/h·g，显著高于紫色土和矿山昔格达土的肽酶活性，紫色土的肽酶

15、活性为农田昔格达土 的 0.83%，矿山昔格达土的肽酶活性则几乎为零，其原因可能也与土地利用方式及污染物含 量有关（表 2）。2.4 -葡萄糖苷酶-葡萄糖苷酶是一种具有生物催化剂功能的蛋白质，其全称为 -D-葡萄糖苷葡萄糖水解 酶。-葡萄糖苷酶可以裂解二聚糖和多聚糖及 -葡萄糖苷中的 -葡萄糖苷键。在供试土壤中， 紫色土和农田昔格达土的 -葡萄糖苷酶活性明显高于矿山昔格达土，其中紫色土的酶活性 为 12041.47±2430.43 nmol/h·g ，矿山昔格达土的 -葡萄糖苷酶活性为 873.84±133.36 nmol/h·g，为紫色土的 50.94

16、%，农田昔格达土的 -葡萄糖苷酶活性为 4944.61±805 nmol/h·g， 为紫色土的 7.26%（图 1-4）。土壤的 -葡萄糖苷酶酶活性除了与土地耕作方式、有机质和 土壤类型有关，还与土壤 pH、阳离子交换量以及土壤细菌的丰度有关，具体原因有待进一 步分析。2.5 多酚氧化酶多酚氧化酶可以参加腐殖质组分中芳香族有机化合物的转化。在空气存在的情况下，它 们酶促酚氧化成酮。在适宜的条件下，某些酚通过酶促反应还可以与氨基酸和肽缩合，形成 土壤中最初的胡敏酸分子10。矿山昔格达土的多酚氧化酶活性为 1.37±0.30 mol/h·g，农田 昔格达土的

17、多酚氧化酶活性为 0.72±0.06 mol/h·g，紫色土该酶活性仅为 0.41±0.07 mol/h·g（图 1-5）。实验结果表明，有机质含量高的土壤多酚氧化酶活性低，反之则高。同时，矿 山昔格达土中常以氧化态存在的元素含量较高，如 Cu 全量为 420.6 mg kg-1，Fe 全量为16.06%，V 全量为 632.0 mg kg-1，Ti 全量为 2.67 mg kg-1 等。土壤氧化还原电位可能是影响土壤多酚氧化酶活性的重要原因之一。对供试土壤的氧化还原电位的分析结果表明，矿山昔 格达土的氧化还原电位（581.7 mv）显著高于农田昔格达土

18、（507 mv）和紫色土（512.7 mv） 的氧化还原电位。2.6 过氧化物酶土壤磷酸酶活性 （nmol h-1 g-1)Soil sulphatase activity (nmol h-1 g-1)过氧化物酶可以利用由于微生物的活动和某些氧化酶的作用而在土壤中形成的过氧化 氢和其他有机过氧化物中的氧，氧化土壤有机物质，从而对腐殖质的形成产生重要作用11。 相对于土壤多酚氧化酶，供试土壤的过氧化物酶的活性较低，紫色土仅为0.029±0.004 mol/h·g；而过氧化物酶活性较高的矿山昔格达土为0.154±0.004 mol/h·g，农田昔格达土 的过

19、氧化物酶活性为0.096±0.001 mol/h·g，表现出与土壤多酚氧化酶相似的趋势（图1-6）。土壤硫酸酯酶活性 （nmol h-1 g-1)Soil sulphatase activity (nmol h-1 g-1)350300250200150100500紫色土 农田昔格达土 矿山昔格达土9000800070006000500040003000200010000紫色土 农田昔格达土 矿山昔格达土图1-1 土壤硫酸酯酶活性 图1-2 土壤磷酸酶活性土壤肽酶活性 （nmol h-1 g-1)Soil peptidase activity (nmol h-1 g-1)4

20、50004000035000300002500020000150001000050000土 壤 -葡萄糖苷酶活性 ( n mgo l) h紫色土 农田昔格达土 矿山昔格达土-1 -1-1 -1Soil -glucosidase activity (nmol h g )1600014000120001000080006000400020000紫色土 农田昔格达 土矿山昔格达土 图 1-3 土壤肽酶活性 图 1-4 土壤 -葡萄糖苷酶活性1.81.61.41.21.00.80.60.40.20.0紫色土 农田昔格达土 矿山昔格达土-1 -1-1 -1Soil peroxidase activity

21、 ( mol h g )0.1800.1600.1400.1200.1000.0800.0600.0400.0200.000土壤过氧化物酶活性 （ mol h g )紫色土 农田昔格达土 矿山昔格达土3 结论土壤多酚氧化酶活性 （ mol h-1 g-1)Soil phenoloxidase activity ( mol h-1 g-1)图 1-5 土壤多酚氧化酶活性 图 1-6 土壤过氧化物酶活性图 1 供试土壤酶活性Fig 1. Enzyme activity of tested soils采用紫外微孔板及荧光微孔板酶检测技术可以快速测定土壤中的酶活性。供试土壤中，采自农田的昔格达土的硫酸

22、酯酶、磷酸酶和肽酶活性显著高于采自矿山的昔格达土和紫色土的相关酶活性，供试紫色土 -葡萄糖苷酶活性高于昔格达土的 -葡萄糖苷酶活性，而采自 矿山的昔格达土的多酚氧化酶和过氧化氢酶活性高于采自农田的昔格达土和紫色土的相关 酶活性。该方法是否同样可以快速测定其他各种母质发育的、不同 pH 和不用土地利用方式 的土壤的酶活性，还需进行大量的数据积累。土壤酶活性与土壤理化性质、土壤污染程度、 土地利用方式等的相关性，还需进一步研究。参考文献 (References)1 周礼恺. 土壤酶活性的总体在评价土壤肥力水平中的作用J. 土壤学报,l983,20 (4):413-417. 2 杜伟文,欧阳中万.

23、土壤酶研究进展J. 湖南林业科技,2005,32 (5):76-79,82.3 Mersi W, Schinner F. An improved and accurate method for determining the dehydrogenase activity of soils with iodonitrotetrazolium chloride J. Biology and Fertility of Soils, 1991, 11 (3): 216-220.4 Benítez E, Melgar R, Sainz H, Gómez M, Nogales R. Enzyme activities in the rhizosphere of pepper(Capsicum annuum, L.) grown with olive cake mulches J. Soil Biology and Biochemistry, 2000, 32 (13):1829-l835.5 Burns R G, Dick R P. Enzymes in the e