质粒提取原理和方法

1、质粒提取原理和方法质粒提取原理和方法质粒DNA提取的原理及方法碱裂解法质粒DNA提取原理质粒DNA提取主要包括以下几个方面：如何将细 胞裂解释放质粒DNA如何将质粒DNA和基因组 DNA分离开来，如何去除RNA亏染，如何去除蛋 白质和其它杂质。质粒提取方法中，最常用的方法是碱裂解法，它 具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。 其原理是：强碱性条件下，质粒DNA和基因组DNA同时从细 胞中释放出来，并发生变性。在 pH中性，并有 高盐浓度存在的条件下，质粒DNA会迅速发生复 性，仍为可溶性状态，染色体DNA之间交联形成 不溶性网状结构，在去垢剂SDS乍用下，染色体 DNA与变性蛋白质和细胞碎

2、片结合形成沉淀，通 过离心去除沉淀后，再用酚氯仿抽提进一步纯化 质粒DNA用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。 BIOMIGA公司质粒DNA纯化系列试剂盒，采用碱 裂解法质粒提取原理，在高盐环境下，采用硅胶 膜特异性的吸附质粒DNA而蛋白质不被吸附， 最后用低盐洗脱液将DNA从膜上洗脱下来，方法 简单，快速，质量好，收获量高。影响质粒提取的因素影响质粒提取的因素有很多种，如质粒拷贝数， 宿主菌株的种类，细菌的培养时间、培养基种类、 培养条件等等。质粒拷贝数质粒DNA最终收获量取决于质粒的拷贝数和质 粒的大小。BIOMIGA公司质粒DNA提取系列试剂 盒，操作步骤适用于高拷贝数质粒的纯化，对于低拷

3、贝质粒纯化提取，应加大起始菌液量的体 积，并且相应地增加各种缓冲液的用量。下表给出一些常用质粒载体的拷贝数：质粒种类复制起点拷贝数1 mL菌液质粒DNA攵获量（卩g）pSCIOIpSCIOI5pACYCP15A10-12pSuperCos pMB1 10-200.4-1pBR322 pMB1 15-200.6-1pGEMRMuted pMB1 300-4006-7pBluescriptRColE1300-5006-8 pUCMuted pMB1500-7008-12宿主菌株宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。 含内源 核酸酶的宿主菌株，如 JM101, JM110, HB101,TG1以及它们

4、的衍生菌株，通常因为内源核酸酶 的存在，或者在提取过程中释放出来的核酸酶的 作用下，将会显著影响最终收获量，或者纯化到 的质粒容易降解，推荐客户将质粒转化至不含内 源核酸酶的宿主菌株中，如Top10, DH5a进行质 粒纯化。如果从含内源核酸酶的宿主菌株中纯化质粒 DNA请用试剂盒附送的核酸酶去除溶液，去除 核酸酶的污染。或选用HP系列试剂盒进行质粒 的纯化。下表给出一些常用的宿主菌株种类：EndA- Strains of E. ColiDH5aDH1DH21JM106JM109SK2267SRBXLOTOP10DH10BJM103JM107SK1590MM294Stbl2 ?XL1-Blue

5、BJ5182DH20JM105JM108SK1592Select96 ?Stbl4 ?XL10-GoldEn dA+ Strai ns of E. ColiC600JM110RR1ABLE? CCJ236KW251P2392BL21(DE3)HB101TG1TB1ABLE? KDH12SLE392PR700BL21(DE3) pLysSJM101JM83TKB1HMS174ES1301M1061Q358BMH 71-18All NM strai nsAll Y strai ns菌液培养BIOMIGA公司质粒DNA提取系列试剂盒，标准操 作适用于在LB培养基中培养1216小时，OD600 在2.

6、03.0的菌液质粒DNA勺提取。如果使用丰 富培养基，如TB, 2 x YT培养基，请保证 OD600 不超过3.0。菌液过量，将会影响最终的收获量 和纯度。培养方式如果用于质粒小提，请从固体培养基平板上挑取 新鲜单菌落，接种到加入筛选抗生素的培养基 中，震荡培养1216小时。如果用于中提、大提或超大提，请按照以下方式 制备菌液：挑取单克隆，接种到15mL培养基中，进行初摇， 然后按照1:1000的比例进行放大培养，培养瓶 中培养基的体积最好不要超过培养瓶的 1/4体 积。抗生素浓度的选择对含有抗性的质粒载体，在进行筛选或培养时应 加入相应的抗生素。各种抗生素的工作浓度请参照下表：抗生素溶解性

7、保存条件严紧型质粒松弛型质粒 氨苄青霉素50 mg/mL（溶于水）-20 °C20 卩 g/mL60 卩 g/mL羧苄青霉素50 mg/mL溶于水-20 C20 卩 g/mL60 卩 g/mL氯霉素34 mg/mL溶于无水乙醇-20 C25 卩 g/mL170 1 g/mL卡那霉素10 mg/mL溶于水-20 °C10 1 g/mL50 i g/mL链霉素10 mg/mL溶于水-20 C10 i g/mL50 i g/mL四环素5 mg/mL溶于无水乙醇-20 C10 i g/mL50 i g/mL质粒质量鉴定纯化到的质粒DNA一般可以通过以下三种方式 进行质量鉴定。琼脂糖凝胶电泳检测 理想条件下，经碱裂解法纯化到的质粒 DNA应 该只出现超螺旋一条带。但在质粒提取过程中机 械力，强碱溶液的作用等原因，纯化到的质粒常 常会出现三条带，甚至有时候会出现四条带 （变 性超螺旋），不管是哪种形式的超螺旋，经单酶 切后，呈现一条带，则说明提取结果正常，没有 基因组污染。酶切鉴定纯化到的质粒，进行进一步的酶切操作，鉴定质 粒的大小。紫外分光光度计检测纯化到的质粒，稀