肝细胞癌中NOS和VEGF的表达及其与肿瘤血管形成的关系

1、    肝细胞癌中NOS和VEGF的表达及其与肿瘤血管形成的关系        【摘要】目的研究型、型一氧化氮合酶(iNOS、eNOS)和血管内皮生长因子(VEGF)在肝细胞癌中的表达及其与肿瘤血管形成的关系。方法应用免疫组化方法检测71例肝细胞癌患者手术切除石蜡包埋标本的iNOS、eNOS、VEGF的表达，抗CD34单克隆抗体显示血管内皮细胞。根据CD34阳性的血管内皮细胞计数来测定肿瘤微血管密度(MVD)。结果iNOS、eNOS分别在83.1%、85.9的肝癌中阳性表达，

2、而正常肝组织不表达。iNOS阳性的肝癌组织59例MVD为34.3±1.5/高倍视野，iNOS阴性的组织为31.2±2.8/高倍视野，两者差异有显著性(P0.01)；VEGF阳性肝癌组织61例MVD为38.6±1.6/高倍视野，VEGF阴性组织为22.4±2.0/高倍视野，两者差异有显著性(P0.01)。VEGF、iNOS表达均阳性者42例；VEGF表达阴性、而iNOS表达阳性者17例。VEGF、eNOS表达均阳性者43例；VEGF表达阴性、而iNOS表达阳性者18例。表明iNOS、eNOS的表达与VEGF的表达无相关性(P0.05)。结论iNOS、eNO

3、S在肝炎后肝硬化的恶性转化中起作用，iNOS、VEGF可促进肝癌肿瘤血管形成。【主题词】肝肿瘤；癌，肝细胞；一氧化氮合酶；血管内皮生长因子；肿瘤血管形成 Nitric oxide synthase and vascular endothelial growth factor expression in hepatocellular carcinoma and their relation to angiogenesisWANG Lu,TANG Zhaoyou,SUN Huichuan,et al.(Liver Cancer Institute,Zhongshan Hospital,Shangh

4、ai Medical University,Shanghai 200032,China)【Abstract】ObjectiveTo analyse inducible nitric oxide synthase (iNOS),endothelial nitric oxide synthase (eNOS),vascular endothelial growth factor (VEGF) protein expression in hepatocellular carcinoma (HCC) and their relation to angiogenesis.MethodsTissue se

5、ctions from 71 HCC patients were examined immunohistochemically for protein expression of iNOS,eNOS,and VEGF.Microvessal density (MVD) was counted by endothelial cells immunostained by anti-CD34 antibody.ResultsPositive iNOS and eNOS immunostaining was detected in 83.1% and 85.9% of HCC respectively

6、.iNOS and eNOS were not detected in normal hepatic tissue.MVD was 34.3±1.5/HP and 38.6±1.6/HP in HCC positive for iNOS and VEGF while it was 31.2±2.8/HP,and 22.4±2.0/HP in HCC negative for iNOS and VEGF respectively (P0.01).A correlation between NOS expression and VEGF in HCC was

7、 not observed.ConclusioniNOS and eNOS may play a role in malignant transfornation of post-hepatic cirrhosis.The expression of iNOS and VEGF favors angiogenesis of HCC.【Subject words】Liver neoplasms;Carcinoma,hepatocellular;Nitric oxide synthase;Vascular endothelial growth factor;Angiogenesis肿瘤血管形成是肿

8、瘤生长、转移的基础1。自从Weidner等2报道了肿瘤组织微血管密度(MVD)是乳腺癌患者的一个独立的预后指标以来，在许多肿瘤，包括原发性肝癌中MVD的预后价值都得到了肯定3。一氧化氮合酶(NOS)活性的增高与肿瘤血管形成关系密切4。我们利用手术切除的原发性肝癌标本，进行iNOS、eNOS、VEGF和肿瘤血管染色，研究NOS、VEGF的表达与肝癌形成肿瘤新生血管之间的关系，探讨一氧化氮的产生在肝癌VEGF诱导肿瘤血管形成的信号传导途径中的作用。材料与方法1.资料来源：收集1992年1月1993年5月上海医科大学附属中山医院肝癌研究所手术切除的原发性肝癌标本71例，男性59例，女性12例。年龄2

9、978岁，平均49.6岁。65例（91.5）伴有肝硬化改变，64例血清HBsAg阳性。按1994年WHO病理分类标准，71例均为肝细胞癌。2.标本制备及免疫组化染色：标本中性甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，厚4 m，除1张做常规HE染色外，余片均用于免疫组化染色。抗体来源见表1。免疫组化二步法染色主要步骤：石蜡切片常规脱蜡水化；组织抗原微波修复（枸橼酸盐缓冲液0.01 mol/L，pH 6.0，5 min×2）；滴加一抗，湿盒中37温箱孵育1 h；滴加envision试剂，置湿盒中，室温孵育30 min；上述各步骤之间均以TBS(0.01mol/L，pH 7.4)洗片3次。DAB显色，

10、苏木素复染细胞核，封片。用TBS分别代替一抗、二抗作阴性对照。表1主要试剂使用情况试剂类型工作浓度来源iNOS多抗(N-20)1200Santa Cruz公司eNOS多抗(C-20)1200Santa Cruz公司VEGF单抗(Ab-3)1100Santa Cruz公司CD34单抗(QBEnd 10)1100Dako公司Envision单抗Dako公司3.结果判定：NOS和VEGF阳性判断：二者都为细胞浆着色，按肿瘤细胞着色强度及阳性细胞分布范围分为二个等级：以 1030%细胞呈弱、中等强度阳性反应为标准，分为阴性及阳性。肿瘤MVD的测定方法：切片在100倍光镜下挑选微血管分布最高区域，在20

11、0倍视野下(0.708 mm2/每视野)计数5个视野的被CD34染成棕色的血管数目，取其平均值作为微血管密度，每一与邻近的微血管明显分离的阳性染色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇都视为独立的微血管5。 4.统计学方法：统计分析采用Epinfo 6软件进行。对MVD的比较用t检验，免疫反应结果之间及其与临床复发的关系采用2检验。 结果1.免疫组化表达的一般特点：NOS和VEGF均为细胞浆着色，在71例肝癌组织中有59例(83.1%)表达iNOS，61例(85.9%)表达eNOS，部分肿瘤血管内皮细胞及新生小胆管上皮eNOS也呈阳性。50例(70.4%)表达VEGF，在肿瘤血管内皮细胞及肝窦血管内皮

12、上也有弱阳性表达，部分iNOS及VEGF的癌周表达强度高于癌内。抗CD34抗体特异的与肿瘤组织新生血管内皮细胞反应，与肝硬化组织中的肝血管窦内皮细胞不反应，故染成棕色的血管内皮细胞只分布于肝癌组织内(14)。2.肝细胞癌iNOS、eNOS、VEGF的表达与MVD及预后的关系(表2)：iNOS、VEGF表达阳性的肝癌组织平均MVD分别为34.3±1.5/每高倍视野、38.6±1.6/每高倍视野，而阴性的组织则为31.2±2.8/每高倍视野、22.4±2.0/每高倍视野(P0.01)。iNOS、eNOS与肝癌的复发无关。虽然VEGF阳性的病例复发率(23/5

13、0，46%)高于VEGF阴性的病例(5/21，23.8%)，但统计学分析这种差异无显著性(P=0.06)。表2iNOS、eNOS、VEGF的表达与MVD及预后的关系组别例数MVD (±s)P值5年复发率(%)P值iNOS(-)1216.931.2±2.833.3()5983.134.3±1.50.00357.60.25eNOS(-)1014.133.7±11.540.0(+)6185.932.1±12.50.9555.70.47VEGF(-)2129.622.4±2.023.8()5070.438.6±1.6<0.01

14、46.00.063.iNOS、eNOS表达与VEGF的关系：本研究中，VEGF、iNOS表达均阳性者42例；VEGF表达阴性、而iNOS表达阳性者17例。VEGF、eNOS表达均阳性者43例，VEGF表达阴性、而eNOS表达阳性者18例。表明iNOS、eNOS的表达与VEGF的表达无相关性(P0.05)。讨论在正常状态下，肝细胞仅含极微量NOS，通过对体外培养的肝细胞进行Northern 印迹杂交，需延长放射自显影的时间方能检测出肝细胞内所含的少量NOSmRNA6。我们的研究证实，在原发性肝癌的肿瘤组织及癌周肝硬化组织中，表达较高水平的iNOS及eNOS，提示在肝炎后肝硬化恶性转化及肝癌的进展

15、中一氧化氮的产生起一定的作用。一氧化氮在肿瘤进展中起着双刃刀样作用，与肿瘤组织局部的一氧化氮浓度、肿瘤类型、肿瘤细胞对一氧化氮的敏感性有关。如使肿瘤组织产生大量的一氧化氮则对肿瘤细胞产生毒性作用，并能促进细胞的凋亡，阻断肿瘤形成新生血管而有抑瘤作用7。但肿瘤细胞暴露于低浓度的一氧化氮环境(通常在实质肿瘤微环境中产生的一氧化氮浓度较引起细胞凋亡的浓度低12个数量级)或肿瘤细胞通过别的机制如环氧化酶-2的产生能够抵制一氧化氮的损伤，则肿瘤组织中的一氧化氮在肿瘤的进展和血管形成中起促进作用。实体肿瘤中血管内皮细胞和肿瘤细胞产生的内源性一氧化氮在保证肿瘤最大血供、维持肿瘤生长中起重要作用，包括扩张肿瘤

16、组织中的血管和促进肿瘤血管形成增加。一氧化氮同时能使小动脉扩张，减少白细胞和内皮之间的相互作用，增加血管通透性。Jenkins等8将iNOS基因转染的人结肠腺癌细胞株移植到裸鼠体内，肿瘤生长速度较对照组快且出现较多新生血管，肿瘤的侵袭性也更强。Gallo等9报道头颈部鳞癌随着NOS(eNOS和iNOS)活性增高，肿瘤血管密度也增加。我们研究了71例肝细胞癌iNOS及eNOS的表达及其与肝癌新生血管的关系，结果显示iNOS表达阳性的肝癌组织MVD(平均为34.3±1.5/每高倍视野)高于iNOS阴性组织的MVD(平均为34.3±1.5/每高倍视野，P0.01)；eNOS阳性的

17、肝癌组织MVD平均为32.1±12.5/每高倍视野，阴性组织为33.7±11.5/每高倍视野(P0.05)。表明iNOS及VEGF在促进肝癌的肿瘤血管形成中起一定的作用，而eNOS的作用则不明显。肿瘤血管形成是正负调节因子之间平衡调节的结果，VEGF是最强的可溶性血管形成因子。本组71例肝细胞癌组织中有50例(70.4%)VEGF阳性表达，其MVD平均为38.6±1.6/每高倍视野，21例(29.6%)阴性的癌组织则为22.4±2.0/每高倍视野(P0.01)，显示VEGF有促进肝癌肿瘤血管形成的作用。肿瘤细胞产生的VEGF与内皮细胞表面的受体结合，通过

18、细胞内钙调蛋白及磷酸肌醇途径能够增强NOS的表达，刺激产生一氧化氮，一氧化氮在细胞内进行信号传导，促进血管内皮细胞分裂，诱导肿瘤血管形成，一氧化氮在VEGF诱导肿瘤血管形成的每一步骤均起重要的作用10。我们的结果显示，在iNOS阳性肝癌组织中，VEGF阳性病例26例，阴性病例23例；iNOS阴性的肝癌组织中，VEGF阴性病例4例，VEGF阳性病例8例(P0.30)，二者表达无相关性，但免疫组化反应结果显示，iNOS和VEGF的表达在癌周都强于癌内，其阳性表达区域有重复，似乎提示它们有相同的激活途径。eNOS阳性的肝癌组织中，VEGF阳性有29例，VEGF阴性有22例；eNOS阴性的肝癌组织中，

19、VEGF阳性有6例，VEGF阴性有4例(P0.57)。研究表明iNOS、eNOS与VEGF表达无相关性，这与所采用的试验方法有关，也可能为NOS和肝癌血管形成所依赖的其他血管形成因子有关。我们没发现iNOS、eNOS、VEGF的表达与肝癌的复发有关。本研究结果显示，iNOS的活性与肝癌的血管形成密切相关，而MVD的测定在判断肿瘤的预后上存在着局限性，如不能提供血管形成的生化途径、不能用来监控疗效和对肿瘤血管形成进行总的评价9。如同时检测NOS的表达及活性，将提供有关血管形成更多的肿瘤生物行为信息。1肝癌组织中iNOS阳性表达Envision二步法×1002肝硬化组织中iNOS阳性表达

20、Envision二步法×1003肝癌组织中VEGF阳性表达Envision二步法×1004肝癌组织中CD34阳性表达Envision二步法×100基金项目：上海市医学领先学科基金、美国中华医学基金会基金资助项目(93-583)；国家重点基础研究(恶性肿瘤)基金资助项目(G1998051211)作者单位：王鲁(上海医科大学中山医院肝癌研究所200032)汤钊猷(上海医科大学中山医院肝癌研究所200032)孙惠川(上海医科大学中山医院肝癌研究所200032)叶胜龙(上海医科大学中山医院肝癌研究所200032)纪元(中山医院病理科)陆洪芬(上海医科大学肿瘤医院)施达仁(

21、上海医科大学肿瘤医院)参考文献1，Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? J Natl Cancer Inst,1990,82:4-6.2，Weidner N,Folkman J,Pozza F,et al.Tumor angiogenesis:a new significant and independent indicator in early-stage breast carcinoma.J Natl Cancer Inst,1992,84:1875-1887.3，Sun HC,Tang

22、 ZY,Li XM,et al.Immunohistochemical study of angiogenesis in hepatocellular carcinoma:its relationship with prognosis.J Cancer Res Clin Oncol,1999,125:419-426.4，Ziche M,Morbidelli E,Masini S,et al.Nitric oxide mediats angiogenesis in vivo and endothelial cell growth and migration in vitro promoted b

23、y substance P.J Clin Invest,1994,94:2036-2044.5，Vermeulen PB,Gasparini G,Fox SB,et al.Quantification of angiogenesis in solid human tumors:an international consensus on the methodology and criteria of evaluation.Eur J Cancer,1996,32A:2474-2484.6，Geller DA,Nussler AK,Silvio MD,et al.Cytokines,endotoxin and gluc