醛固酮对肾小球系膜细胞合成分泌纤维连接蛋白和TGF(一)

1、醛固酮对肾小球系膜细胞合成分泌纤维连接蛋白和TGF(一)    【关键词】 醛固酮;,肾小球系膜细胞;,纤维连接蛋白;,转化生长因子1Effects of aldosterone on synthesis of fibronectin and expression of transforming growth factor1 mRNA in cultured rat mesangial cellsAbstract AIM: To eva luate the effect of aldosterone (ALD) and spironolactone (S

2、PI, one of the aldosterone receptor antagonists) on synthesis and secretion of fibronectin (FN) and expression of transforming growth factor1 (TGF1 ) mRNA in cultured rat mesangial cells. METHODS: (1)Mesangial cells were treated with medium containing different concentrations of ALD (10-11, 10-9, 10

3、-7 mol/L) and/or 10-7 mol/L SPI for 48 h, while control cells were treated with vehicle only. The levels of FN in the supernatants were measured by ELISA method. The expressions of FN mRNA and TGF1 mRNA were detected by semiquantitative RTPCR. (2)Mesangial cells were treated with 10-9 mol/L ALD for

4、24, 48, 72 h. The levels of FN in the supernatants were measured by ELISA method. The expressions of FN mRNA and TGF1 mRNA were detected by semiquantitative RTPCR. RESULTS: ELISA method showed that the level of FN in the supernatant of cultured rat mesangial cells stimulated with ALD increased signi

5、ficantly in a dose and timedependent manner. Also the expressions of FN mRNA and TGF1 mRNA were increased significantly by ALD in a dose and timedependent manner by semiquantitative RTPCR. SPI inhibited the stimulating effect of ALD on synthesis of FN and expressions of FN mRNA and TGF1 mRNA in cult

6、ured rat mesangial cells. CONCLUSION: ALD upregulates the protein synthesis and mRNA expression of FN, and upregulates the mRNA expression of TGF1 in cultured rat mesangial cells. SPI inhibits the effect of ALD, and thus implication in the treatment of Glomerulosclerosis.Keywordsaldosterone; mesangi

7、al cells; fibronectin; TGF1摘 要 目的: 研究醛固酮（ALD）及其受体拮抗剂螺内酯（SPI）对大鼠肾小球系膜细胞合成分泌纤维连接蛋白（FN）, 以及对转化生长因子1(TGF1 ) 基因表达的影响。方法: (1)以不同浓度的ALD (10-11、 10-9、 10-7 mol/L) 及/或 10-7 mol/L SPI刺激肾小球系膜细胞48 h后, 用ELISA法测定培养上清中FN的浓度。用半定量RTPCR法检测该细胞中FN mRNA和TGF1 mRNA 的表达。(2)以10-9 mol/L的ALD刺激系膜细胞不同时间 （24、 48、 72 h）后, 分别用上述方法

8、测定培养上清中FN的浓度和细胞中FN mRNA和TGF1 mRNA 的表达。 结果: (1)ELISA的结果显示, ALD可促进系膜细胞合成分泌FN, 且呈剂量和时间依赖性, SPI能拮抗ALD的作用。(2)半定量RTPCR的结果显示, ALD可促进系膜细胞FN mRNA和TGF1 mRNA的表达, 也呈剂量和时间依赖性, SPI也能拮抗ALD的作用。结论: ALD在蛋白和基因水平上均可促进大鼠肾小球系膜细胞合成分泌FN, 及TGF1 mRNA的表达, SPI能拮抗ALD的作用, 具有一定的肾脏保护作用, 从而有益于延缓肾小球硬化的进展。关键词醛固酮; 肾小球系膜细胞; 纤维连接蛋白; 转化生

9、长因子1近年来, 肾素血管紧张素醛固酮系统(reninangiotensinaldosterone system, RAAS) 在慢性肾脏疾病进展中的作用越来越受到重视, 血管紧张素II是这一系统中造成肾脏损害的主要物质。最近动物实验表明, 醛固酮(ALD)也是这一系统中造成肾脏损害的重要物质, ALD可能通过血流动力学改变和直接作用于肾脏固有细胞发挥作用, 其作用机制目前尚未完全明了1。肾小球系膜细胞是肾小球固有细胞中合成细胞外基质最强的细胞, 是导致肾小球硬化的特殊间质效应细胞。本实验利用体外培养的大鼠肾小球系膜细胞, 研究了ALD及其受体拮抗剂螺内酯（SPI）对系膜细胞合成分泌纤维连接蛋

10、白（FN）, 以及对转化生长因子1(TGF1 ) mRNA表达的影响, 以探讨ALD在肾小球疾病中的作用, 并为临床应用SPI治疗慢性肾小球疾病提供实验依据。1 材料和方法1.1 材料 DALD、 SPI购自Sigma公司。大鼠FN ELISA试剂盒购自上海太阳公司。Trizol总RNA提取试剂及逆转录（RT）试剂盒购自Invitrogen公司。其他试剂为国产分析纯。80120 g雄性SD大鼠购自北京大学医学部实验动物中心。1.2 方法2 结果2.1 ALD对培养的大鼠肾小球系膜细胞合成分泌FN的影响 随着ALD浓度的升高, 系膜细胞培养上清中FN的含量逐渐升高。ALD的浓度在10-7 mol

11、/L时, FN的含量最高, 与对照组比较, 差异有统计学意义（P001）, 表明ALD可促进系膜细胞合成分泌FN, 且呈剂量依赖性。10-7 mol/L SPI组FN的含量与对照组相比较差异无统计学意义（P>005）。10-7 mol/L SPI与10-9 mol/L ALD共同作用于系膜细胞48 h, FN的含量与对照组相比较, 差异也无统计学意义（P>005）; 但与10-9 mol/L ALD组相比较, 差异有统计学意义（P005）, 表明SPI能够拮抗ALD的作用（表1）。另外, 随著作用时间的延长, 培养上清中FN的含量逐渐升高。48 h和72 h组与对照组相比较, 差异

12、有统计学意义（P001）, 表明ALD可促进系膜细胞合成分泌FN, 并具有时间依赖性（表2）。表1 不同浓度的ALD和SPI刺激对培养48 h的肾小球系膜细胞培养上清中FN水平的影响（略）Tab 1 The effects of different concentrations of ALD and SPI stimulation on FN level in culture supernatant of mesangial cells cultured for 48 hoursbP0.01 vs control group; aP0.05 vs 10-9 mol/L ALD group.表2

13、 10-9 mol/L ALD作用不同时间对培养的肾小球系膜细胞上清中FN水平的影响（略）Tab 2 The effects of different times of 10-9 mol/L ALD stimulation on FN level in culture supernatant of mesangial cellsbt=-4.216, bP0.01; dt=-3.782, dP0.01 vs control group, respectively.2.2 ALD对培养的大鼠肾小球系膜细胞FN mRNA表达的影响 随着ALD浓度的升高, FN mRNA的表达量（以FN/GAPDH

14、mRNA表示）明显增加, 分别为对照组的111、 146和168倍（P001）, 表明ALD可促进系膜细胞FN mRNA的表达, 且具有剂量依赖性。10-7 mol/L的SPI组FN mRNA的表达量与对照组相比较, 差异无统计学意义（P>005）。10-7 mol/L SPI与10-9 mol/L ALD共同作用于系膜细胞48 h, FN mRNA的表达量与对照组相比较差异无统计学意义（P>005）, 但与10-9 mol/L ALD组相比较, 差异有统计学意义（P005）, 说明SPI能拮抗ALD的作用（表3）。随著作用时间的延长, FN mRNA的表达量明显增加, 分别为对照

15、组的118、 156及167倍（P005）, 表明ALD促进系膜细胞FN mRNA的表达, 且具有一定的时间依赖性（表4）。表3 不同剂量ALD对肾小球系膜细胞中FN mRNA的表达（略）Tab 3 The effects of different doses of ALD on FN mRNA expression in mesangial cellsaP0.05, bP0.01 vs control group; cP0.05 vs 10-9 mol/L ALD group.表4 ALD作用不同时间对系膜细胞中FN mRNA表达的影响（略）Tab 4 The effects of different times exposure to ALD on FN mRNA expression in mesangial cellsaP0.05, bP0.01 vs control group.表5 ALD对肾小球系膜细胞TGF1 mRNA的表达（略）Tab 5 The effect of different doses of ALD on TGF1 mRNA expression in mesangial cellsaP0.0