中药调整性早熟儿童青春发育进程的机制研究

1、中药调整性早熟儿童青春发育进程的机制研究 作者：蔡德培，陈伯英，张炜，李嫔【关键词】 ,中药 摘要 目的：从神经内分泌调节及基因表达的角度，探讨调整性早熟儿童青春发育进程的滋阴泻火中药和益肾填精中药有效调节下丘脑垂体促性腺机能、促生长机能的作用机制。方法：青春期大鼠分别予以喂饲滋阴泻火中药或益肾填精中药。采用神经生物学实验方法（下丘脑推挽灌流、组织匀浆、脑片孵育及免疫组化法）检测下丘脑促性腺区促性腺激素释放激素（gonadotropinreleasing hormone, GnRH）的含量、脉冲释放频率与幅度，以及中枢氨基酸递质、神经肽Y及内啡肽释放的变化；采用定量逆转录聚合酶链反应检测下丘脑

2、GnRH、生长激素释放激素（growth hormone releasing hormone, GHRH）、生长抑素（somatostatin, SS）、腺垂体卵泡刺激素（follicular stimulating hormone, FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone, LH）、生长激素（growth hormone, GH）、长骨干骺端胰岛素样生长因子（insulinlike growth factor, IGF）基因及蛋白的表达水平。结果：滋阴泻火中药可明显抑制下丘脑促性腺区兴奋性氨基酸递质的释放，促进抑制性氨基酸递质、神经肽Y和内啡肽的释放，使下丘脑GnRH神

3、经元的功能活动降低，下调GnRH、FSH及LH基因的表达水平，上调下丘脑SS基因的表达，并下调垂体GH及长骨干骺端IGF基因的表达，从而明显抑制下丘脑垂体的促性腺机能及促生长机能。益肾填精中药则可明显抑制下丘脑促性腺区神经肽Y的释放，使下丘脑GnRH神经元的功能活跃，上调GnRH、FSH及LH基因的表达，下调下丘脑SS基因的表达，上调垂体GH及长骨干骺端IGF基因的表达，从而明显促进下丘脑垂体的促性腺机能及促生长机能。结论：滋阴泻火中药和益肾填精中药可通过调整机体的神经内分泌调节机制，调整下丘脑GnRH、SS，腺垂体FSH、LH、GH及长骨干骺端IGF基因的转录，有效调节下丘脑垂体的促性腺机能

4、及促生长机能。这可能是滋阴泻火中药和益肾填精中药可有效调整性早熟患儿青春发育进程及改善骨骼发育的主要作用机制。关键词 中药; 青春期，早熟; 神经递质; 神经肽Y; 内啡肽; 下丘脑垂体性腺轴; 生长抑素生长激素胰岛素样生长因子轴Effects of Chinese herbal medicine on modulating the course of puberty development in children with precocious pubertyABSTRACT Objective: To explore the therapeutic effects of Ziyin Xie

5、huo Recipe (ZYXHR) for nourishing yin and lowering fire and Yishen Tianjing Recipe (YSTJR) for nourishing kidney and replenishing essence on regulating the gonadotrophic and somatotrophic functions of hypothalamicpituitary axis, and to reveal the mechanisms of ZYXHR and YSTJR in modulating the cours

6、e of pubertal development of children with precocious puberty. Methods: The pubertal rats were fed with ZYXHR or YSTJR for 30 days, and the parameters of rats were monitored as the followings: The content of gonadotropinreleasing hormone（GnRH）, the frequency and amplitude of GnRH impulse releasing,

7、the releasing amounts of aminoacid neurotransmitters, and neuropeptide Y (NPY) and endorphin (END) in the gonadotrophic area of the hypothalamus were detected with neurobiological methods (pushpull perfusion, homogenate, incubation of brain slices, and immunohistochemical staining). The levels of ge

8、ne and protein expressions of GnRH, growth hormone releasing hormone (GHRH) and somatostatin (SS) in hypothalamus, and follicular stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH) and growth hormone (GH) in adenohypophysis as well as insulinlike growth factor (IGF) in metaphysis were determined wi

9、th real time reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR). Results: The ZYXHR could reduce the activity of GnRH neurons in hypothalamus through inhibiting the release of central exciting aminoacid neurotransmitters, whereas promoting the release of central inhibiting aminoacid neurotransmi

10、tters, NPY and END in gonadotrophic area of hypothalamus. The expression levels of GnRH, FSH and LH mRNAs were downregulated while the expression level of SS mRNA in hypothalamus was upregulated in the ZYXHRtreated group. The GH mRNA in hypophysis and the IGF mRNA in metaphysis were both downregulat

11、ed by ZYXHR. The YSTJR could promote the activity of GnRH neurons in hypothalamus through inhibiting the release of NPY in gonadotrophic area of hypothalamus, upregulating the expression levels of GnRH, FSH, LH and GH mRNAs in hypophysis, and IGF mRNA in metaphysis, while downregulating the expressi

12、on level of SS mRNA in hypothalamus. Conclusion: The ZYXHR and YSTJR could both regulate the gonadotrophic and somatotrophic functions of hypothalamicpituitary axis through modulating the neuroendocrine regulation and the gene expressions of GnRH and SS in hypothalamus, GH, FSH and LH in hypophysis,

13、 and IGF in metaphysis. These may be the chief mechanisms of ZYXHR and YSTJR in modulating the course of pubertal development and ameliorating the skeletal development in children with precocious puberty.KEY WORDS Chinese materia medica; puberty, precocious; neurotransmitters; neuropeptide Y; endorp

14、hin; hypothalamicpituitarygonadal axis; somatostatingrowth hormoneIGF axis复旦大学医学院儿科医院近十余年来对儿童特发性性早熟的发病规律、诊断及治疗进行了系统的研究，制定了一套调整其青春发育进程的中药治疗方案，包括在起病时诱导其缓解，缓解后巩固并维持疗效，待至正常青春期年龄时，则促使其更好地青春发育。临床研究已证实该中药治疗方案能有效地调整患儿的青春发育进程并改善其骨骼发育1。本研究系在临床已取得疗效的基础上，进一步从神经内分泌调节及基因表达的角度研究该中药治疗方案的作用机制。1 材料与方法1.1 实验动物 同窝SD雌性大

15、鼠240只，1.5月龄（相当于青春期），体质量160180 g，饲养于自然光照环境中。1.2 动物分组及药物处理 240只大鼠随机分为3组：（1）滋阴泻火中药组80只，喂饲滋阴泻火中药；（2）益肾填精中药组80只，喂饲益肾填精中药；（3）正常对照组80只，喂饲等量生理盐水。滋阴泻火中药（Zhiyin Xiehuo Recipe, ZYXHR）由生地黄15 g、炙龟板12 g、黄柏9 g、知母9 g、牡丹皮9 g等组成；益肾填精中药（Yishen Tianjing Recipe, YSTJR）由熟地黄15 g、龟板胶9 g、仙灵脾9 g、鹿角胶9 g、肉苁蓉9 g、菟丝子9 g等组成。由复旦大学

16、医学院儿科医院中药制剂室煎制成浓缩合剂，约含生药3 g/ml。每组大鼠均予以灌胃给药，1次/d，5 ml/d，治疗30 d为1个疗程。1.3 检测指标1.3.1 下丘脑促性腺区神经递质及神经肽的含量 兴奋性氨基酸递质谷氨酸（glutamic acid, Glu）、天门冬氨酸（aspartic acid, Asp）及抑制性氨基酸递质氨基丁酸（aminobutyric acid, GABA）采用推挽灌流及高效液相色谱法检测；内啡肽（endorphin, END）采用推挽灌流及放射免疫法检测；神经肽Y（neuropeptide Y, NPY）采用免疫组化法检测。1.3.2 下丘脑促性腺区促性腺激素释

17、放激素（gonadotropinreleasing hormone, GnRH）的释放方式及含量 （1）GnRH周期性分泌中心下丘脑内侧视前区（medial preoptic area, MPOA）：采用推挽灌流及放射免疫法测定GnRH脉冲释放的频率与幅度；组织匀浆、放射免疫法及免疫组化法测定GnRH的含量。（2）GnRH紧张性分泌中心内侧基底下丘脑弓状核（arcuate nucleus, ARC）及正中隆起（median eminence, ME）：采用脑片孵育、放射免疫法及免疫组化法测定GnRH的含量。1.3.3 下丘脑GnRH mRNA、腺垂体卵泡刺激素（follicular stimu

18、lating hormone, FSH）mRNA、黄体生成素（leuteinizing hormone, LH）mRNA的表达水平 采用定量逆转录多聚酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RTPCR）方法进行检测2。1.3.4 下丘脑生长激素释放激素（growth hormone releasing hormone, GHRH）mRNA、生长抑素（somatostatin, SS）mRNA的表达水平 采用漂浮法原位杂交技术进行检测。1.3.5 腺垂体生长激素（growth hormone, GH）mRNA、肝脏胰岛素样生长因子

19、（insulinlike growth factor, IGF）mRNA及长骨干骺端IGF mRNA的表达水平 采用实时荧光定量RTPCR方法进行检测。1.3.6 下丘脑SS蛋白及腺垂体GH蛋白的表达水平 采用免疫组化法进行检测。1.4 神经生物学实验方法1.4.1 推挽灌流 用0.35% 戊巴比妥按10 ml/kg予以大鼠腹腔注射麻醉后，采用脑立体定位仪固定大鼠头部，将推挽套管插至视前区（含视前内侧核）。在大鼠处于清醒状态时予以灌流，用恒流泵推动人工脑脊液，以50 l/min的速度注入视前区, 稳定30 min后开始收集灌流液，每10 min收集1管，连续收集2 h。灌流结束后，在灌流套管内

20、注入20 l绘图墨水后取出全脑，10% 多聚甲醛固定1周后，切片观察套管位置，定位准确者其灌流液可用于样品检测。收集的样品置于70 保存，备GnRH、NPY及氨基酸类递质的测定。1.4.2 组织匀浆 大鼠断头，迅速取出全脑，置于冰浴上，分离视前区。组织用冰酸性丙酮溶液抽提，2次超声匀浆，4 离心5 000 r/min，10 min，合并上清液，真空抽干后置20 保存，稀释后备GnRH的测定。1.4.3 脑片孵育 大鼠断头，迅速取出全脑，置于冰浴上，分离内侧基底下丘脑（含弓状核及腹内侧核），垂直切成2片，迅速移入0.5 ml人工脑脊液（预先置于37 水浴中，并通以95% O2和5% CO2）中孵

21、育。平衡30 min后，更换新的人工脑脊液0.5 ml，再孵育30 min后，收集孵育液。收集的样品置于70 保存，备氨基酸类递质的测定。1.4.4 免疫组化 大鼠在乙醚吸入麻醉下，开胸暴露心脏，从其左心尖向左心室插入11号注射针头。先以温生理盐水200 ml快速冲净组织内血液，继以冰冻的4%多聚甲醛磷酸缓冲液（pH 7.4）250300 ml予以灌注，取出大鼠全脑，先后移入20%蔗糖多聚甲醛液及30%蔗糖磷酸缓冲液中，待下沉后进行冰冻切片，切成30 m厚的冠状脑片，采用抗生物素蛋白生物素过氧化物酶复合物（avidinbiotinperoxidase complex, ABC）法进行常规免疫组

22、化染色后，用Leica图像分析处理系统测定阳性物质的积分光密度值。1.4.5 高效液相色谱荧光法 采用高效液相色谱荧光法检测灌流液样品中的兴奋性氨基酸递质（Glu, Asp）及抑制性氨基酸递质（GABA）的含量，用Beckman公司的System gold软件进行梯度控制及色谱数据处理，以外标法计算样品浓度。1.4.6 GnRH、END及NPY的放射免疫法测定 上述收集的孵育液及灌流液样品中的GnRH、END及NPY含量均按常规放射免疫法测定。1.5 统计学方法 所有实验数据均采用SPSS 11.0软件予以统计学处理，计量资料均数用xs表示，组间比较采用t检验及单因素方差分析。2 结果2.1

23、滋阴泻火中药对下丘脑促性腺区神经递质及END释放的影响 滋阴泻火中药组下丘脑内侧视前区Asp及Glu的释放量较正常对照组明显减少，而GABA及END的释放量则明显增加，差异有统计学意义。提示滋阴泻火中药可使下丘脑内侧视前区兴奋性氨基酸递质的释放明显减少，抑制性氨基酸递质及内啡肽的释放明显增加。见表1。2.2 滋阴泻火中药及益肾填精中药对下丘脑促性腺区NPY释放及含量的影响 滋阴泻火中药组下丘脑NPY含量较正常对照组明显增加，差异有统计学意义，提示滋阴泻火中药可促进下丘脑NPY蛋白的表达；而益肾填精中药组ARC及ME处NPY的含量较正常对照组则有明显减少，差异有统计学意义，提示益肾填精中药可以抑

24、制内侧基底下丘脑NPY蛋白的表达。见表2。2.3 滋阴泻火中药对下丘脑促性腺区GnRH释放及含量的影响2.3.1 滋阴泻火中药对下丘脑视前区GnRH脉冲释放方式的影响 检测一系列按时间顺序收集的灌流液样品，可以反映下丘脑视前内侧核GnRH脉冲释放的频率与幅度。滋阴泻火中药组GnRH脉冲释放的幅度比正常对照组明显降低，其脉冲释放频率也明显减低，差异有统计学意义，提示滋阴泻火中药可以明显抑制下丘脑视前内侧核GnRH的脉冲分泌。见表3。表1 滋阴泻火中药对下丘脑视前区氨基酸递质及END释放的影响（略）Table 1 Effects of ZYXHR on releasing contents of aminoacid transmitters and END in preoptic area of hypothalamus*P0.05, *P0.01, vs normal control group.表2 滋阴泻火与益肾填精中药对下丘脑NPY含量的影响（略）Table 2 Effects of