最新常用的半抗原与蛋白偶联方法简介

1、常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutylchloroformate method ）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在 有机溶剂中形成混合酸酐 （mixed acid an hydride）, 然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。氨甲喋吟（MIT）与p-半乳糖苷酶偶联的混合 酐法1、5. 8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至 10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分 钟。2、1.5mg 酶用 2ml 50 m mol/L Na2CO3 溶解。3、10度反应4小时（必要时加NaOH

2、以维持溶液的 pH为9.0 , q然后4度过夜。4、 过 sephadex G-25 层析柱，柱用含NaCI 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇 10 m mol/L 的50m mol/L Tris- 醋酸缓冲液（pH7.5）平衡和洗 脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保 存于含 BSA 0.1 %（w/v ）、NaN3 0.02%（w/v）的缓冲 液中。碳化二亚胺法制备 3,3,5-三碘甲腺氨酸-血蓝 蛋白免疫原的操作步骤1、取 EDC 100mg ,用 pH8.0 的 10 m mol/L PBS液 2.5ml使之充分溶解（I液2、取3 , 3,5

3、-三碘甲腺原氨酸25mg ,用0.2mol/L NaOH 溶液 2ml 溶解（II 液）3、取血蓝蛋白（lemocyanin） 25mg,溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III 液）4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴 加入I液（余下0.5ml :5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I 液6、4度搅拌12小时7、静置10小时（4度&有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。孕酮与与3 -半乳糖苷酶偶联的 N-羟琥珀酰亚 胺酯法1、用二垩烷（dioxane）溶解孕酮-11-半琥珀酸 酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。2、加羟琥珀酰亚胺（N-hydroxy

4、succi ni mide）100 m mol/L禾口 DCC （二环已基碳化二亚胺），200m mol/L, 4 度反应16小时。3、用簿层扫描方法纯化（氯仿：水=9: 1）4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上 述溶液加入到酶液（用 pH7.4,浓度50 m mol/L的 磷酸缓冲液溶解）中。5、（二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、 用 0.1 mol/L HCl 溶液配制 4 m mol/L 浓度的半抗原。2、滴加1% NaNO2过量）,4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或 在白色磁砖上加1 %淀粉和 50m m

5、ol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉 反应变成蓝黑色。3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。4、 用pH9.0、浓度为 200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。5、边搅拌，边加入重氮化的半抗原(防止局部发生酸过量 现象)，调节pH到9.5。6、冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到9.0。 7、用PBS透析2天8-20度保存(浓度为20mg/mL 双功能的酰亚胺酯(imidateesters)可以氨基反应，形成脒。例如：用二甲基已二酰亚胺酯 (dimethyladipimide) 将去 甲基三 正喋吟 (desmethylmortriptyline) 与 3

6、 -半乳糖苷酶偶联。应用双功能酰亚胺酯(imidate esters )制备 去甲基三正喋吟-与3-半乳糖苷酶标记特的操作步 骤1、 用含5%( W/V N-乙基吗啉的无水甲醇 0.4ml,在室温下溶解570ug去甲基三正喋吟和488ug 二 甲基已 二酰亚 胺酉旨(dimethyladipimide)(A 液)2、 取与3 -半乳糖苷酶100 ug,溶于 pH9.9 的 100 m mol/L 碳酸缓冲液(含 MgCI2 10m mol/L,2- 巯 基乙醇 10 m mol/L 0.1ml(B 液) 3、将A液倒入B液。4、20度反应90分钟后，力口含 NaCI 100 m mol/L,

7、MgCl2 10 m mol/L 和 2-巯基乙醇 10 m mol/L、pH7.5 的 Tris- 醋酸缓冲液(50m mol/L) 1ml,终止反应。5、过sephadex G-25,去除小分子物质，得酶标记物(约75%的酶与半抗原结合，但用三正喋吟 代替去甲三正喋吟 (demethylmortriptyli ne ) 进行 偶联，则只有15%的酶与之结合。(三)含巯基半抗原的偶联 可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。此外，将载体蛋白用溴乙酰胺（bromoacetamide）激 活。或将载体蛋白与半抗原在pH4.0的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半 抗原连接到蛋白质分子上。

8、（四）含羟基的半抗原偶联醇类羟基通过形成半琥珀酸酯转化为羧基的操 作步骤1、15g 2,2,2-三氯乙醇（2,2,2-trichloroethanol ）,12g 琥珀酸酐（succinican hydride）禾口 8.7ml 三乙基胺（triethylamime） 用 100 ml乙酰乙酯溶解。2、加热回流1小时。3、减压蒸馏去溶剂，,残余物用5% NaHCO水溶液溶解。4、用乙醚洗涤两次，然后用 H2SO4进行s酸化（pH到2.0）. 5、用水洗涤固形物（为三氯乙基半琥珀酸酯）两次，用氯仿-已烷使其结晶（产量约 75%,熔点 88-89度）6、 取 2.5g半琥珀酸酯溶于6.5ml亚硫酰

9、氯（thionyl chloride）中，65度加热30分钟。7、减压蒸发，干燥1小时（高度真空条件下）。& 将上述产生（2, 2, 2-三氯忆基琥珀酰氯）溶于 15ml N,N-二甲基-乙酸乙酰胺（N,N- dimethylethylacetamide） 中，室温搅拌反应2 小时。9、65度真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来（得盐酸化的结晶-5-酯约84%,熔点160 度）。10、用溶于二甲基甲酰胺中的锌和醋酸解离 三氯乙酉旨，得f半抗原-半琥珀酸酯，这样引和的羧 基可与蛋白质偶联（如用碳化二亚胺化）。半抗原用NalO4氧化其中的糖苷醇后再与蛋白质偶联的操 作步骤1、 20mg腺苷溶于1ml

10、100m mol/L NaIO4溶液中，4度避光反应30分钟。2、加1滴乙二醇（得A液）3、将A液加入到p -半乳糖苷酶液（20mg/ml,用 150m mol/L NaCI,10m mol/L MgCI2水溶液溶解，用3% K2CO3调节pH至9.0 ）中4、4度反应2小时，期间不断调节pH9.0 5、加入临时配制的 50 mg/ml NaBO4溶液，用量为反应体积的1/10。4度反应过夜。6、用含有 MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇10 mmol/L、NaCl 100 m mol/L 的 50 m mol/L 磷酸缓冲 液（pH7.4）透析（更换透析液数次）（五）含酮基或 酮基

11、半抗原的偶联是将酮基经羟胺类化合物处理变 成肟类化合物，再进一步将肟类化合物中的羟基， 衍变成羧基化合物，再进一步进行含羧基半抗原的 偶联操作。这类羟胺类化合物主要有：氨氧乙酸 aminoxy acetic acid或羧甲氧胺 carboxymethoxylamine或者盐酸羟胺 酮基的类固醇分子中引入羧基 的操作步骤1、在200ml乙醇中，加入O-（羧甲基）羟胺 （O-（carboxyl）hydroxylamine ）和酮基半 抗原，使其浓度分别为10m mol/L和4m mol/L 2、加热回流90分钟3、旋转蒸发，减少容积，然后加水至40ml，用乙醚抽提 4、用水洗涤乙醚抽提物，用 Na

12、2SO4干燥成白色粉末。（六）、其他半抗原的偶联 虽含有游离基 团，但因这些基团对于维其生物活性十分重要，因 些不能直接用来与载体蛋白偶联。制备雌二醇-6-肟的操作步骤a、 雌二醇二醋酸盐的制备1、1g雌二醇溶于14ml吡啶及3.5ml醋酐中2、加热回流1小时，冷却后倾入冰水中。3、收集白色晶体，得产物约1.1g （熔点126到127度）b、雌二醇-6-酮-二醋酸盐的制备4、雌二醇二醋酸盐1.1g，滴加冰醋酸3.8ml溶解后加含 0.93g CrO3的含水冰醋酸 6.35ml (H2O:Hac=0.75:5.6) 5、室温搅拌 1小时，静置 24 小时6、用水稀释，用乙醚提取 4次7、用烝馏水

13、洗 2次&减压蒸馏，得结晶油状渣物。9、用90度烘干20分钟，得粗制品约 500mg10、用11ml无水乙 醇溶解粗制品，再加1.1ml冰醋酸及1.5g吉纳你特 T试剂(Girad T)，回流1小时。11、冷却后，用冰 致冷的蒸馏水稀释，用2.5mol/LNaOH调节pH至6.0-6.2.12、用乙醚抽提 3次，弃去乙醚。13、水层用浓盐酸酸化(盐酸终浓度为1mol/L). 14、室温静置2小时。15、用乙醚抽提3次。16、合并乙醚 抽提液，用0.125mol/L碳酸钠溶液洗1次，用蒸馏 水洗3次。17、用无水硫酸钠脱水，蒸干。18、加 7ml醋酐，回流20分钟。19、冷却后倾入用冰致冷 的蒸馏水中，然后过滤、干燥得产物约176mg (熔点为162-166度)c、 二醇-6-酮的制备20、用 5.5ml 20 %的氢氧化钾-甲醇溶液(W/V)溶解雌二醇- 6-酮-二醋酸盐(176mg ,在室温下于氮气中水解24 小时。21、加蒸馏水稀释，用乙醚抽提 3次。22、 在乙醚提取液中无水硫酸钠进行脱水，蒸发干燥，得产物约60mg熔点为278-282度)d、雌二醇-6-肟的制备23、取雌二醇-6-酮50mg ,盐酸羧