细菌内毒素法标准操作规程

1、细菌内毒素检查法标准操作规程1 简述1.1 本规范适用于中国药典2015年版一部附录中细菌内毒素检查法凝胶法1.2 供试品细菌毒素限值的确定（一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值；（二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=KM 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EUml、Emg、E表示。为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EUkgh表示。其中注射剂，EUkgh；放射性药品注射剂，2.5EUkgh；鞘内用注射剂，K=0.2EUkgh。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以mlkgh、mgkgh、Ukgh表示。药品人用最大剂量可参阅国

2、家批准的药品注说明书和临床用药须知等权威著作，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数（MVD）按下式计算： MVD=C·L L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EUml表示时，C等于1.0mlml；当的单位以EU/mg或EU/U表示时，为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取，可计算供试品的最小有效稀释浓度：L 在凝胶法中为鲎试剂的标示灵

3、敏度。1.4 在使用新一批号的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。1.5 药典中已有规定的品种或有其他内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。1.6 细菌内毒素检查过程中的阴性对照阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则实验结果无效。2 实验材料及用具仪器 天平、电热干燥箱 、恒温水浴箱或适宜的恒温器（37±1）、水银温度计或酒精温度计（精度在1以下）、旋涡混合器、 移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝胶管（10mm×75mm）

4、、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。试剂 鲎试剂、 细菌内毒素国家标准品和细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素检查用水。3 实验准备3.1 玻璃器皿的洗涤 将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留的洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入烤箱。3.2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素 玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至250，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1小时。达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温，在不打开金属容器的情况

5、下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。 凝胶法操作方法4.1 鲎试剂灵敏度复核4.1.1 实验操作4.1.1.1 内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，起开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2、0.5、0.25（为所复核鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均

6、应在旋涡混合器上混合30秒钟（详细过程参见标准品使用说明书）。若使用的为细菌内毒素国家标准品，可按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后分装、保存。若为细菌内毒素工作品，为一次性使用。4.1.1.2 待复核鲎试剂的准备取规格为0.1ml支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混合在一起，然后每0.1ml分装到10mm×75mm凝聚管中

7、，要求至少分配18管备用。4.1.1.3 加样将以充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml的2、0.5和0.25的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。 按最大有效稀释倍数稀释的供试品溶液作为供试品管，1支加入0.1ml用BET水将WSE制成的2浓度的内毒素溶液作为阳性对照，1支加入0.1mlBET水作为阴性对照，1支加入0.1ml供试品阳性对照溶液（相当于用被测供试品溶液将WST制成2浓度的内毒素溶液）作为供试品阳性对照管。4.1.1.4 加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀

8、，避免产生气泡，连同试管架放入37±1水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟。4.1.1.5 观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180。观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从壁管滑脱者为阴性，记录为（-）。4.1.2 实验结果计算如最大浓度2.04管均为阳性，最低浓度0.254管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（c）。式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素标

9、准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。4.1.3 结果判断当c在0.52（包括0.5和2）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以(标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰实验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。并且验证当供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时供试品是否存在干扰作用。由于干扰实验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂的灵敏度无关，因此在干扰实验预实验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。但建议使用较低的灵敏度（

10、如0.5或0.25EU/ml）的鲎试剂，可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰实验造成的阳性影响。4.2.2 干扰实验预实验预实验的目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以EU/mg或EU/U活性单位表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU/ml表示），为正式干扰实验提供依据。4.2.2.1 将无可检测到内毒素的供试品进行一系列倍数的稀释，但最大的稀释倍数不的超过MVD=/0.03（0.03EU/ml为现今我国市售鲎试剂的最高灵敏度）。4.2.2. 使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做支供试品管和2支供试品阳性对照（即用该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成2浓度）。另取支加入

11、细菌内毒素检查用水作为阴性对照，支加入2浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。供试品阳性对照制备举例：制备稀释倍数为的供试品阳性对照液方法，取0.3ml浓度为EU/ml的内毒素标准液0.3ml的稀释倍数为的供试品稀释液制得0.6ml含2EU/ml内毒素标准的稀释倍数为4的供试品稀释液。保温60±2分钟后，观察并记录结果。4.2.2.3 当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效。当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数进行正式干扰实验。当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性

12、，或供试品阳性对照不为阳性时，说明供品对内毒素与鲎试剂的反应存在干扰，则应对供试品进行更大倍数稀释（不得超过MVD=CL/0.03），或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。当供试品的内毒素限值单位为EU/m或EU/U活性单位时，应将最小不干扰稀释倍数换算成最大不干扰浓度（即该稀释倍数下溶液的浓度），以mg/ml或活性单位/ml表示。4.2.2.4 举例例：设某注射液限值为2.5EU/ml，按MVDCL/计算出灵敏度为0.03EU/ml下的MVD为80倍，将供试品溶液稀释一系列检验，用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂进行预实验。结果如下稀释倍数原液10204080供试

13、品溶液供试品阳性对照如上结果可初步确定该样品的最小不干扰稀释倍数为倍，可在此浓度下进行正式干扰实验。4.2.3 正式干扰实验目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。4.2.3.1 制备内毒素标准对照溶液取支细菌内读数标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成个浓度的标准液即、0.5、0.25，（方法同4.1.1.1）。4.2.3.2 制备含内毒素的供试品溶液4.2.3.2.1 将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将4.2.3.1中的同支细菌内毒素标准品稀释成个浓度即、0.5、

14、0.25的含内毒素的供试品溶液。以注射用头孢哌酮（1g/瓶）为例：取10ml检查用水溶解注射用头孢哌酮即为100mg/ml，设需将其稀释20倍（mg/ml）后备用。（注：冻干品或无菌粉末用检查用水溶解后体积有无变化，根据具体情况定）。取一支细菌内毒素标准品，加入1ml检查用水溶解，然后取出内毒素标准溶液0.3ml制备内毒素标准对照溶液；再取内毒素标准溶液0.3ml加上2.7ml的mg/ml头孢哌酮钠溶液，即为含10倍内毒素稀释液的供试品溶液，取0.3ml含10倍内毒素稀释液的供试品加上2.7ml的5mg/ml头孢哌酮钠溶液，即为含100倍内毒素稀释液的供试品溶液。其余依次类推。4.2.3.2.

15、2 简化法制备含内毒素的供试品溶液：0.5ml浓度为1.0EU/ml的内毒素标准溶液0.5ml浓度为10mg/ml的供试品溶液得到1ml的含0.5EU/ml内毒素的浓度为5mg/ml的供试品溶液。同理分别用0.5ml浓度为0.5EU/ml、0.25EU/ml和0.125EU/ml的内毒素标准溶液质备含0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.0625EU/ml内毒素的浓度为5mg/ml的供试品系列溶液。（其体积的大小视情况而定）。4.2.3.3 鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后开启备用，防止玻璃屑落入瓶内。每

16、支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按其标示量加入检查用水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1ml分装到10×75mm凝集管中，要求至少分装36管备用。4.2.3.4 加样将准备好的鲎试剂取其中18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管）， 列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0、1.0、0.5、0.25的内毒素标准溶液，另有一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。将另外18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的

17、4支4列每列每支分别加入0.1ml的含2.0、1.0、0.5、0.25的内毒素的供试品溶液，另一列2支（管）加入0.1ml的供试品溶液作为样品阴性对照。加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37±1水浴或适宜恒温器中，保温60±2分钟后，观察并记录结果。4.2.4 实验结果计算如两组最大浓度2.0均为阳性，最低浓度0.25均为阴性，阴性对照4管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（s）和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（t）。式中Xs、Xt分别为检查用水和供试品溶液或稀释液

18、制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。4.2.3 结果判断当ES在0.52.0（包括0.5和2.0）时，且当Et在0.5ES2.0ES（包括0.5ES和2.0ES）时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。当Et不在0.5ES2.0ES（包括0.5ES和2.0ES）时，则认为供试品在该浓度下干扰实验。应使用适宜方法排除干扰，如对供试品进行更大倍数稀释，是排除干扰因素的简单有效方法。建立新品种细菌内毒素检查方法时，每个厂家至少取三个批号（不包括亚批）的供试品，用两个以上鲎试剂生产厂家的鲎试剂进行干扰试验。4.3 供试品细菌内毒素检查凝胶限度试验在细

19、菌内毒素检查中，每批供试品必须做支供试品管和支供试品阳性对照，同时每次实验必须做支阳性对照和支阴性对照。4.3.1 操作方法4.3.1.1 供试品溶液的制备首先计算MVDC·L/，C、L的意义同1.3。为所使用鲎试剂的标示灵敏度。然后将供试品进行稀释，其稀释倍数不得超过MVD。4.3.1.2 阳性对照溶液的制备用检查用水将内毒素标准品稀释成2浓度的内毒素标准溶液。（方法同4.1.1.1）4.3.1.3 供试品阳性对照溶液的制备用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2浓度的内毒素溶液。（方法同4.2.1.3.2供试品阳性对照溶液的制备）。4.3.1.4 阴性对照液即细菌内毒素

20、检查用用水4.3.1.5 鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若使用的鲎试剂的规格不是0.1ml/支，按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1ml分装到10×75mm凝集管中，要求至少分装管备用。4.3.1.6 加样 取支（管）溶解好的鲎试剂，其中支加入0.1ml供试品溶液或其稀释液（其稀释倍数不得超过MVD）作为供试品管，支加入0.1ml阳性对照液作为阳性对照管（PC），

21、支加入0.1ml检查用水作为阴性对照管（NC），支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管（PPC）。4.3.1.7 将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37±1水浴或适宜恒温器中，保温60±2分钟。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。4.3.2 结果判断当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验方为有效。若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如供试品2管均为阳性，应认为不符合规定；如2管中1管为阳性，1管为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。若第一次实验时供试品

22、的稀释倍数小于MVD而结果出现2管均为阳性或2管中1管为阳性时，按同样方法复试，复试时要求将其稀释至MVD。4.4.3 举例供试品为葡萄糖注射液，其内毒素限值为0.5EU/ml，设所用鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml， MVD=C·L/=0.5/0.125=4将样品进行4倍稀释，并做4倍稀释下的供试品阳性对照。 供试品供试品阳性对照阳性对照阴性对照 结果是否有效 有效结果判断该批葡萄糖注射液的内毒素含量小于0.5EU/ml，符合规定。4.4 凝胶半定量实验半定量实验是使用凝胶法估测供试品中内毒素含量的方法。系利用供试品系列与鲎试剂反应的终点浓度计算出供试品中内毒素的含量。4.4.

23、1 操作方法4.4.1.1 供试品系列的制备用检查用水将供试品溶液从已确定的不干扰浓度或稀释倍数下开始进行对倍稀释，制备成2、4、8等N个浓度，但最大稀释倍数不得超过MVD。N可根据实验设计不同确定。4.4.1.2 内毒素标准系列的制备用检查用水将内毒素标准品稀释成4个浓度的标准溶液即2、1、0.5、0.25，（方法同4.1.1.1）。4.4.1.3 供试品阳性对照溶液的制备用已确定不干扰浓度或稀释倍数的供试品溶液将内毒素标准品制成2浓度的内毒素溶液。（方法同4.2.1.3.2供试品阳性对照溶液的制备）。4.4.1.4 阴性对照液即细菌内毒素检查用水。4.4.1.5 鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支或分装好的鲎试剂12+2N支，其他准备按正式干扰实验项下的“鲎试剂准备”。4.4.1.6 加样将准备好的鲎试剂取其中10支（管）放在试管架上，排成5列，每列2支。其中4列每列每支分别加入0.1ml的2、0.5、0.25的内毒素标准溶液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。将另外2N支（管）鲎试剂放在试管架上，排成N列，每列2支（管）。每列每支分别加入0.1ml一个浓度的供试品溶液。另2支（管）加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品的阳性对照。4.4.1.7 将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37±1水浴或适宜恒温器中，保温60