粥样硬化性颈动脉狭窄动物模型的建立及评价

1、粥样硬化性颈动脉狭窄动物模型的建立及评价        【摘要】     目的 探讨建立经济实用、稳定可靠的粥样硬化性颈动脉狭窄动物模型的条件，并对其进行评价。方法 新西兰白兔24只，采用血管内膜气体干燥损伤法在动物的右侧颈总动脉上造成特定条件的损伤，左侧颈总动脉不做处理作为对照，然后以特定高脂饲料喂养动物不同时间。评价各组动物血管狭窄程度和病理改变特点。结果 4周组、8周组中、重度狭窄均达到80%。病理检查证实高脂喂养8周时，动脉的粥样硬化病理改变已属于较成熟的纤

2、维斑块期。结论 按本实验方法，损伤后喂养8周的动物是实验研究所需要的较为理想的模型。     【关键词】  颈动脉狭窄;粥样硬化;动物模型;兔    Establishment and evaluation of atherosclerotic animal model of carotid stenosisYU Qiu-feng,BAI Lin-gang,ZHANG Shi-de,et al. CT room,Liaocheng Infectious Disease Hospital,Liaocheng

3、 252000,ChinaAbstract Objective To establish the methods and factors affecting the development of an economical,practical，stable and reliable animal model suitable for experimental studies，and to evaluate the animal model.Methods Using 24 Newzealand rabbits，lesions were created by air-drying isolate

4、d segments of the right common carotid arteries and feeding the rabbits with a diet of 1.5% cholesterol，5% lard and 15% egg yolk powder for 2 weeks，4 weeks and 8 weeks separately.The left common carotid arteries does not deal with as a control.Digital subtraction angiograghy was used to evaluate the

5、 stenosis of carotid arteries.Results The average rates of stenosis were calculated and described as following,2-week group: 37.12%±7.98%;4-week group: 69.97%±11.15% and 8-week group: 75.42%±15.21%. The percentage of moderate to severe stenosis of 4-week and 8-week group were all more

6、 than 80% . The pathological studies suggested that fed the atherogenic diet for 8 weeks, the lesions fell into the mature fibrous plaque period.Conclusion In accordance with this experimental method,the animal model of 8-week group is ideal animal model that meets the demand of experimental studies

7、 .Key words atherosclerosis; carotid stenosis; animal model;rabbit动脉粥样硬化(AS)是一种常见的病理现象,是引起多种心脑血管疾病的病理生理基础。颈动脉粥样硬化是引起缺血性脑卒中的重要原因,其中60%的缺血性脑卒中和颈动脉粥样硬化密切相关13。随着对AS发生机制及预防、治疗方面研究的不断深入,迫切需要建立一种简便易行、重复性好、有较典型病理改变、易于评价及适于干预治疗的动物模型。1 材料与方法1.1 实验材料1.2 动物分组 健康新西兰大白兔24只(购自哈尔滨医科大学实验动物中心)，雌雄不拘，体重2.53.0kg。所有动物行右侧

8、颈总动脉(实验组)内膜气体干燥术，左侧颈总动脉(对照组)不作处理。随机将兔子分为A、B、C三组(A组：2周;B组：4周;C组：8周;每组n=8只)。所有动物均单笼喂饲,饮水不限,自由摄食。普通饲料适应性喂养1周后取耳血查血脂，高脂喂养1周后行双侧颈总动脉气体干燥损伤，高脂喂养28周时(A组：2周;B组：4周;C组：8周)分别取耳血查血脂，行颈动脉DSA检查，切取双侧颈动脉固定，以颈动脉病变部为中心进行组织取材和病理学检查。1.3 颈动脉内膜气体干燥损伤法 动物术前12h禁食,不禁水。在严格无菌条件下,经肌肉注射速眠新麻醉动物，剂量0.2ml/kg，麻醉后仰卧固定。颈部脱毛清洁消毒后,正中切皮，

9、于甲状软骨上方水平显露并游离右侧颈总动脉，长约1.21.5cm。两端以动脉夹临时夹闭右侧颈总动脉长约8mm。用26G静脉输液针于近心端夹闭处刺入管腔, 再在远心端刺破颈总动脉，而后针头缩回管腔内。将抽有生理盐水的注射器连接于穿刺针, 用生理盐水灌洗血管腔, 然后医用氮气连接于穿刺针以125ml/min进行干燥, 时间10min;而后以生理盐水置换出管腔内气体，拔出穿刺针,恢复血流。湿润棉片轻轻压迫穿刺点35min止血。缝合皮肤创口并包扎。术后每日肌注青霉素40万U，共5天。1.4 血脂检测 分别于术前和术后2周、4周、8周，经耳缘静脉取血标本3ml,全自动生化分析仪测定胆固醇(TC)、甘油三酯

10、(TG)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)的浓度。1.5 DSA检查 A、B、C三组兔子分别于术后2周、4周、8周行DSA检查,手术切开暴露腹主动脉,穿刺针直视下穿刺,留置管鞘,造影导管造影。1.6 病理学检查 A、B、C三组兔子分别于术后2周、4周、8周取其颈动脉标本,生理盐水冲洗后,10%甲醛溶液保存,常规石蜡包埋,血管横断面作连续切片,分别做HE染色。观察血管内膜、血管壁及血管腔的变化。1.7 血管造影判定颈动脉狭窄程度 以photoshop6.0软件精确测量每根颈动脉狭窄区的最小残腔直径(DMS)和狭窄远端正常颈总动脉直径(DCC)。狭窄率=(DCC-DMS)/DCC&#

11、215;100%;狭窄程度的判定标准：狭窄率<30%为轻度狭窄，30%69%为中度狭窄，70%99%为重度狭窄，100%为完全闭塞。1.8 统计学处理 在微机上用SPSS8.0软件包完成数据的统计处理。数据用均数±标准差表示。多个均数的比较用单因素方差分析(one way ANOV),均数的多重两两比较用LSD检验。2 结果2.1 高脂喂养不同时间家兔血脂测定结果 各时间段血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的检查结果见表1表1 高脂饲料喂养不同时间血脂比较2.2 颈动脉狭窄程度 右侧24根实验血管均有不同程度的狭窄，无完全闭塞

12、者;2周组为轻度狭窄(图1)，4周、8周组多为中重度狭窄(图2);各组平均狭窄率分别是：A组为(37.12±7.98)%;B组为(69.97±11.15)%;C组为(75.42±15.21)%。实验组平均狭窄率A组与B、C组相比均差异有显著性(P<0.05),但B、C组间比较差异均无显著性(P>0.05)。左侧对照组24根血管均无狭窄。图1 2周组右侧颈总动脉轻度狭窄，左侧颈总动脉无狭窄图2 4、8周组右侧颈总动脉、中、重度狭窄，左侧颈总动脉无狭窄2.3 病理检查 A组:内膜轻度增殖;内膜下少许泡沫细胞和脂质沉积,内弹力层基本存在,中膜平滑肌呈梭形排列

13、整齐 ，血管结构基本完整(图3)。B组:内膜增殖较重,内膜中见大量增殖的平滑肌细胞,泡沫细胞较少;中膜开始变薄,中膜内可见泡沫细胞浸入。平滑肌减少,胶原增生。近弹力膜处平滑肌排列紊乱,细胞长轴垂直于内弹力膜排列(图4)。C组:内膜进一步增厚,细胞数目减少,但细胞体积增大,胞内脂质成分增多;细胞外基质明显增多;中膜进一步变薄;并出现纤维化,弹力纤维消失,平滑肌纤维由结缔组织代替,并含有脂滴、泡沫细胞及胆固醇裂隙(图5)。左侧颈总动脉内皮细胞完整,内弹力板完整,中膜平滑肌细胞呈梭形排列整齐,无明显脂质沉积(图6)。3 讨论动脉粥样硬化的发病机制是复杂的, 是综合性的长期过程, 是机体生物网络失衡引

14、起的4。动脉粥样硬化是多因素共同作用的结果,动脉内膜损伤是关键因素之一,内皮细胞的功能障碍是粥样硬化形成的起始阶段。人为的内膜受损则可以加快粥样硬化的形成。Maghadasian5研究表明：高胆固醇饮食可以诱发AS。 LeVeen等6在1982年首次将隔离的动脉段用干燥气体直吹, 损伤血管内壁,附加高脂饲料喂养, 复制兔股动脉粥样硬化病变。现此方法同样适用于颈动脉粥样硬化模型的制作。Van Put7及Chiesa8以兔为实验对象, 用干燥气体损伤结合高脂饲料喂养成功制作颈动脉粥样硬化模型。该方法建立的模型具有如下优点:损伤相对轻柔, 损伤最严重的是内膜，中膜损伤相对轻微。与球囊法制作的模型相比

15、,空气造模并未造成动脉壁的全层损伤。内皮细胞的修复与内膜的增殖过程更接近颈动脉疾病的生理过程;可重复性好,操作简便,易于确定损伤部位。本研究利用高脂喂养加颈动脉空气干燥法建立了颈动脉粥样硬化的模型,在病理检查中发现,手术侧的对侧颈动脉没有发现粥样硬化的病理改变, HE染色见对侧颈动脉和正常的HE染色相近,弹力纤维染色见对侧颈动脉的内膜为一层内皮细胞,即没有增生;同时血管造影发现右侧颈总动脉可以见到不同程度的狭窄,而对侧的颈总动脉血管壁光滑,管腔无狭窄。说明空气干燥术后人为地使血管内膜受到损伤,可以加快颈动脉粥样硬化形成的过程。流行病学资料提示，血清胆固醇水平的升高与AS的发生呈正相关。随着对脂

16、蛋白研究的深入，人们发现主要是低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平与AS的发生呈正相关9，其机制是LDL可以通过apoB100与细胞外基质相互作用沉积在动脉内膜下形成粥样硬化斑块10。另有研究表明1113氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)可以损伤内皮细胞，刺激血管平滑肌细胞增殖，导致血管细胞凋亡。本实验高脂喂养28周时LDL-C较基础值显著增高(P<0.05)，能充分发挥其极强的促粥样硬化作用。杨宝田等14通过实验认为HDL制剂能较大幅度地降低总胆固醇和TG的水平,可清除AS的面积达70%以上,AS的病理学改变可从级转变为级。说明HDL是具有抗粥样硬化作用的成分,本实验高脂喂养28周，H

17、DL均显著高于其基础值(P<0.05)，说明动物体内抗粥样硬化的作用显著增强。TG主要反映膳食因素，高脂喂养28周，TG值均明显高于其基础值(P<0.05)，并且无明显变化，说明在高脂喂养期内，动物对脂质的摄取相对稳定。2周组、4周组、8周组血管狭窄程度分别为(37.12±7.98)%;(69.97±11.15)%;(75.42±15.21)%。实验结果表明随着喂养时间的延长血管狭窄程度逐渐加重。但统计分析表明，4周组及8周组两组间平均狭窄率差异无显著性(P>0.05)。4周组、8周组中度以上狭窄超过80%，重度狭窄率都达到50%。因此，仅从狭窄程度考虑，4周组、8周组的狭窄程度皆符合实验研究需要。动脉粥样硬化病理显示：喂养2周时就出现了内皮细胞的变性和内膜增厚,并有少量的泡沫细胞形成;喂养4周时内膜进一步增厚