O-甘露糖转移酶(Pmtps)缺陷的毕赤酵母菌株的构建及应用

1、O-O-甘露糖转移酶（甘露糖转移酶（PmtpsPmtps）缺陷的毕赤酵母菌株构建及应用缺陷的毕赤酵母菌株构建及应用指导老师：高国龙 副教授 吴军 研究员学 生：李思强贵州师范大学硕士学位论文报告内容报告内容1.背景介绍2.研究内容 毕赤酵母表达抗Her-2抗体存在O-糖基化修饰 PMT1插入失活或PMT5敲除及O-糖基化的研究 过表达HAC1提高毕赤酵母表达抗Her-2抗体的研究3.总结4.展望糖蛋白的表达系统： 哺乳动物细胞：成本高，生产周期长、难放大酵母：优点：低成本，操作简单 ，表达水平高，而且 具有真核细胞的翻译后修饰能力。N-N-连接的糖链连接的糖链O-O-连接的糖链连接的糖链带来的

2、问题：带来的问题：1. 1. 被甘露糖受体识别，在人体内易被清除，半衰期短。被甘露糖受体识别，在人体内易被清除，半衰期短。2. 2. 在人体内有高免疫原性。在人体内有高免疫原性。3.3.可能会影响蛋白的正确折叠、蛋白的活性及表达可能会影响蛋白的正确折叠、蛋白的活性及表达1.1.背景介绍背景介绍缺点：高甘露糖型糖基化修饰解决方案：酵母糖基工程改造解决方案：酵母糖基工程改造哺乳动物O-糖基化的形成过程开始发生于高尔基体中，O-糖型组成比较复杂哺乳动物的O-糖链极少数为O-甘露糖链哺乳动物O-甘露糖链的结构较少、开始发生于内质网，糖链不具有裸露的甘露糖酵母O-糖基化过程以及O-糖链的结构酵母O-糖链

3、的结构开始发生于内质网，糖链具有裸露的甘露糖，潜在的糖基化位点较多YeastMammalian cell酵母与哺乳动物O-甘露糖基化过程Endoplasmic reticulum酵母与哺乳动物表达蛋白O-糖基化的主要区别1：O-糖链的结构明显不同(裸露的甘露糖)2：O-糖链的形成过程不同3：发生在酵母中的O-糖基化，可能会竞争表达异源糖 蛋白本身O-糖基化的位点4：在哺乳动物细胞不发生O-糖基化的异源蛋白，在酵 母表达时可能发生O-糖基化酵母O-糖链的结构哺乳动物O-糖链的结构ERGolgi图 哺乳动物（a）酵母（b）宿主菌：糖基工程酵母菌GJK01（och1）酵母与哺乳动物N-糖基化本本研究

4、意义以及内容研究意义以及内容研究意义 本研究通过抑制PMT基因家族成员的活性，探究降低毕赤酵母表达蛋白O-糖基化的方法，期望能在具有低甘露糖型N-糖基化表达系统的毕赤酵母工程菌中进一步降低O-糖基化，为酵母表达异源蛋白O-糖基化的降低、消除以及人源化改造打下基础，在糖蛋白类药物在酵母中的高效表达以及应用方面具有重要意义。 研究内容 插入失活PMT1基因以及O-糖基化的研究 敲除PMT5基因以及O-糖基化的研究 过表达HAC1提高毕赤酵母表达抗Her-2抗体的研究 解决O-甘露糖基化检测方法缺乏等问题112.2.研究研究内容内容 PMT1插入失活或PMT5基因的敲除以及O-糖基化的研究 毕赤酵母

5、表达抗Her-2抗体存在O-糖基化修饰 过表达HAC1提高毕赤酵母表达抗Her-2抗体的研究图 HiTrap rProteinA FF亲合柱纯化GJK01-HL（och1）表达报告蛋白-抗Her-2抗体人IgGGJK01 检测O-甘露糖基化方法的建立1：排除封闭蛋白中甘露糖蛋白的干扰问题2：排除N-糖链中甘露糖的干扰问题原理 利用伴刀豆球蛋白ConA特异性结合甘露糖的特点，结合Western Blot，建立一种检测O-甘露糖基化的方法。00.020.040.060.080.10.12奶粉BSA纯化前BSA纯化后OD 图 不同封闭液含甘露糖示意图 排除封闭蛋白中甘露糖蛋白的干扰问题1：ConA产

6、品说明书推荐使用的封闭液效果不好图 利用PBST（2%tween20）封闭时WB检测结果2：常用的封闭蛋白中含有甘露糖蛋白3：纯化后的BSA是理想的封闭蛋白图 BSA经Q柱纯化时的洗脱峰00.020.040.060.080.10.12奶粉BSA纯化前BSA纯化后OD 图：SDS-PAGE和Western blot分析GJK01表达抗Her-2抗体O-糖基化ConA检测GJK01表达抗Her-2抗体O-糖基化1：排除N-糖链中甘露糖的干扰问题2：PNGF酶中不含有甘露糖蛋白3：毕赤酵母表达抗体存在O-糖基化现象质量肽谱分析GJK01表达抗Her-2抗体重链的O-糖基化图 GJK01表达抗Her-

7、2抗体重链胰蛋白酶切后质谱分析肽谱分析GJK01表达抗体可能O-糖基化片段GJK01GJK01肽段肽段预测值预测值+M+M序列序列氨基酸位置氨基酸位置抗体位置抗体位置1234.76262.15+6MSR418-419CH31311.81501.31+5MTKPR292-295CH21434.841110.56+2MLSCAASGFNIK20-30VH1493.81682.34+5mYADSVK60-65VH1734.881085.64+4mTISKAKGQPR338-347CH318951570+2MDTYIHWVRQAPGK31-43VH18951085.64+5MTISKAKGQPR338

8、-347CH32153.081182.61+6M1GRFTISADTSK66-76VH2163.091189.51+6MEEQYNSTYR296-304CH22238.171264.66+6MSTSGGTAALGCLVK137-150CHI2544.192382.25+1MDTYIHWVRQAPGKGLEWVAR31-50VH2544.191895.98+4MGLEWVARIYPTNGYTR44-59VH2544.191570.81+6MDTYIHWVRQAPGK31-43VH结论：抗体重链发生O-糖基化1：利用ConA特异性结合甘露糖的特点结合Western blot的 方法建立一种分析O-

9、甘露糖基化的方法。小结2：毕赤酵母表达抗Her-2抗体存在O-糖基化现象。19研究内容研究内容 毕赤酵母表达抗Her-2抗体存在O-糖基化修饰 PMT1插入失活或PMT5基因的敲除以及O-糖基化的研究 过表达HAC1提高毕赤酵母表达抗Her-2抗体的研究构建PMT1基因失活载体图 PCR钓取CYC1TT终止子图 PCR钓取PMT1基因片段图 PCR融合PMT1片段与CYC1TT片段PCR鉴定PMT1基因插入失活菌图 PCR鉴定pmt1插入失活菌图 GJK11-HL(och1，pmt1)鉴定引物设计示意图 图 GJK11与GJK01表达抗Her-2抗体的比较A:SDS-PAGE; B:Weste

10、rn blot 羊抗人IgG; C:Western blot,ConA抗Her-2抗体的ConA检测1:抑制PMT1基因的表达，降低了GJK01表达抗Her-2抗体的O-糖基化。2：抑制PMT1基因的表达，减少抗体重链的降解PMT5敲除载体的构建图 PCR钓取pmt5上下游同源臂 1：pmt5上游同源臂;2：pmt2下游同源臂;M图 PCR连接PMT5上下游同源臂1: PMT5上下游同源臂融合片段；M图 PMT5基因同源臂引物设计示意图Mlu1Mlu1Mlu1利用二次重组敲除PMT5基因图 两步同源重组敲除PMT5基因示意图图 PCR鉴定PMT5基因的敲除PCR鉴定PMT5基因的敲除图 PCR

11、鉴定PMT5基因的敲除引物设计示意图PMT5基因成功敲除图 Western blot鉴定GJK15表达抗Her-2抗体 . 羊抗人IgG图 SDS-PAGE鉴定GJK15表达抗Her-2抗体抗Her2抗体在GJK15中的表达及鉴定图：Western blot检测PMT5敲除对表达抗Her-2抗体O-糖基化的影响图A：羊抗人IgG检测；图B：ConA检测抗Her-2抗体的ConA检测PMT5基因的单独敲除对毕赤酵母表达抗体的O-糖基化没有明显影响小结1.利用基因插入失活的方法，在具有低甘露糖型N-糖基化修饰的毕赤酵母工程菌GJK01中抑制PMT1基因的表达，降低了GJK01表达抗Her-2抗体的

12、O-糖基化，并减少抗体重链的降解2.利用二次同源重组技术，在具有低甘露糖型N-糖基化修饰的毕赤酵母工程菌GJK01中敲除PMT5基因，证实PMT5基因的敲除不能明显影响毕赤酵母表达抗Her-2抗体的O-糖基化。29研究内容研究内容 毕赤酵母表达抗Her-2抗体存在O-糖基化修饰 过表达HAC1提高毕赤酵母表达抗Her-2抗体的研究 PMT1插入失活或PMT5基因的敲除以及O-糖基化的研究图 酿酒酵母非折叠蛋白响应途径示意图非折叠蛋白响应途径UPR途径Hac1p是激活UPR途径的关键HAC1表达载体由实验室构建宿主菌为GJK11-HL(och1，pmt1) GJK15-HL(och1，pmt5)

13、前两章构建前两章构建图 PCR鉴定pPIC9-HAC1在毕赤酵母GJK11-HL( (och1，pmt1) )中的表达图 PCR鉴定载体pGE-GAP-HAC1在毕赤酵母GJK15-HL( (och1，pmt5) )中的表达 PCR鉴定HAC1在毕赤酵母中的表达HAC1在毕赤酵母中表达过表达HAC1基因对菌体生长速度的影响过表达HAC1基因对菌体生长速度没有明显影响图 SDS-PAGE鉴定 GJK11- HAC1-HL( (och1，pmt1，HAC1) )增加抗Her-2抗体的表达图 SDS-PAGE鉴定GJK15-HAC1-HL( (och1，pmt5，HAC1) )增加抗Her-2抗体的

14、表达 SDS-PAGE鉴定抗Her-2抗体的表达过表达HAC1基因能够提高酵母表达抗体的水平ELISA鉴定抗Her-2抗体的表达图 不同毕赤酵母突变株抗体的表达量74.6367.39 107.58 66.71 114.41过表达HAC1基因能够显著提高酵母表达抗体的水平0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 140.00 1表达量mg/LGJK01PMT1-PMT1-HAC1+PMT5-PMT5-HAC1+ P0.05小结 在具有低甘露糖型N-糖基化修饰的毕赤酵母工程菌GJK01中抑制PMT1基因或PMT5基因表达的基础上，过表达转录因子HAC1基因，显著提高毕赤酵母表达抗Her-2抗体的水平。3. 结论1. 建立一种分析O-甘露糖基化的方法，并利用这种方法检测 到毕赤酵母表达抗Her-2抗体存在O-糖基化的现象。2. 抑制PMT1基因的表