Western_Blot详解及问题分析

1、 Western Blot Western BlotWestern Blot 简介：p印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。p1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。p而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 Western Blotl首先利用首先利用

2、SDS-PAGESDS-PAGE对蛋白质样品进行分离，然后转移到对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体（例如固相载体（例如NCNC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不性不变。变。l转移后的转移后的NCNC膜就称为一个膜就称为一个印迹（印迹（blotblot）, ,用于对蛋白质的用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如5%5%的的BSABSA或脱脂奶粉或脱脂奶粉溶液）处理以封闭溶液）处理以封闭NCNC膜上剩余的疏水结合位点，而

3、后用所膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的要研究的蛋白质的抗体（一抗）抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。 Western Blotp直接法： Western Blotp间接法：优点： 1.免疫特异性不受标记影响 2.信号放大,灵敏度高（多个二抗结合位点） 3.多种标记的二抗可供

4、选择 4.可选择不同的Marker缺点： 1.有交叉反应引起的非特异性条带 2.额外的二抗孵育以及条件优化 Western Blot处理过的印迹进一步用适当标记的处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗处理，二抗二抗是指一抗的抗体，是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠是抗鼠IgGIgG的抗体。处理后，带有的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗特定目前有结合各种标记物的抗特定IgGI

5、gG的抗体可以直接购买作的抗体可以直接购买作为二抗，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处为二抗，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。质位置。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。 Western Blot直接法直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标二抗可用于很多种

6、不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。所以一般情二抗分子，所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都况下都釆釆用用间接法间接法进行检测。进行检测。 Western Blot结合了凝胶电泳的高分辨率和固结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点相免疫测定的特异敏感等多种优点p 高分辨率的电泳技术高分辨率的电泳技术p 特异敏感的抗原特异敏感的抗原- -抗体反应抗体反应p 1-5ng 1-5ng （最低可到（最低可到1010100pg100pg）中等大）中等大小的靶蛋白小的靶蛋白 We

7、stern Blotq目的蛋白的表达特性分析q目的蛋白与其它蛋白的互作q目的蛋白的组织定位q目的蛋白的表达量分析被广泛地应用于蛋白质研究，基础医被广泛地应用于蛋白质研究，基础医学和临床医学的研究。学和临床医学的研究。 Western Blotl蛋白样品的制备蛋白样品的制备SDS-PAGESDS-PAGE转膜转膜封闭封闭一抗杂交一抗杂交二抗杂交二抗杂交底物显色底物显色 Western Blot Western Blot Western Blot1.SDS1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 MSDSM配胶的Tris缓冲液MTEMEDM过硫酸铵MTris

8、-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成分凝胶成分 Western Blot1.1 PAGE1.1 PAGE：聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰是由单体丙烯酰胺胺(acrylamide(acrylamide，简称，简称Acr)Acr)和交联剂和交联剂(crosslinker)(crosslinker)N,NN,N- -亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺(N,N(N,N-methylenebisacylamide-methylenebisacylamide，简称简称Bis)Bis)在催化剂和加速

9、剂作用下聚合交联而成的三维网在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。度。是良好的电泳介质。 Western Blot聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式： 单体：丙烯酰胺（单体：丙烯酰胺（AcrAcr）；）； 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（交联剂：甲叉双丙烯酰胺（BisBis）；）； 催化剂：过硫酸胺或核黄素（催化剂：过硫酸胺或核黄素（APAP）；）； 加速剂：四甲基乙二胺（加速剂：四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）；）； 产物：三维网状结构凝胶产物：三维网状结

10、构凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)(free radicals)的催化，使体系发生氧化还原作用的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)(catalyst-redox systems)来来完成的。催化体系主要有化学催化（完成的。催化体系主要有化学催化（APAPTEMEDTEMED）和光化学催化）和光化学催化（核黄素（核黄素TMTEDTMTED）体系。）体系。n影响聚丙烯酰胺凝胶聚合的因素：试剂的纯度；温度；氧气；影响聚丙烯酰胺凝胶聚合的因素：试剂的纯度；温度；氧气；APAP、T

11、EMEDTEMED原则：尽量少的催化剂并在最佳时间内聚合原则：尽量少的催化剂并在最佳时间内聚合。 Western Blotp2SDS-PAGE上样缓冲液：上样缓冲液：pDTT可临用前以可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。冻存。p按按1:1比例与蛋白质样品混合，比例与蛋白质样品混合，95100加热加热515min，冰上冷却后，冰上冷却后再上样，再上样，使蛋白充分变性，使蛋白充分变性，保证蛋白质从空间结构变为一级结构。保证蛋白质从空间结构变为一级结构。p电泳样品已准备就绪，可立即使用也可以分装冻存，电泳样品已准备就绪，可立即使用也可以分装冻存

12、，-20存放的样品存放的样品可稳定保持数月。可稳定保持数月。1M Tris-HCl(pH6.8)10 ml1M DTT20 mlSDS4 g甘油甘油20 ml溴酚蓝溴酚蓝0.2 g总体积总体积100ml100mM Tris-HCl(pH6.8)200mM DTT4%SDS0.2%溴酚兰溴酚兰20%甘油甘油ddH2O Western BlotpSDS-PAGESDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入是在蛋白质样品中加入SDSSDS和含有巯基乙醇的和含有巯基乙醇的样品处理液，样品处理液，是一种很强的是一种很强的，它可，它可以以，破坏蛋白质分子的二级，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。和三级结构。p强还

13、原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTTDTT）可以可以断开二硫断开二硫键破坏蛋白质的四级结构键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与形成单链分子。解聚后的侧链与SDSSDS充分结合形成带负电充分结合形成带负电荷的蛋白质荷的蛋白质-SDS-SDS复合物。复合物。p蛋白质分子结合蛋白质分子结合SDSSDS阴离子后，所带负电荷的量远远超阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移

14、率主要决定于亚基蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。 Western BlotSDS：p阴离子去污剂阴离子去污剂 变性剂变性剂p氨基酸侧链与氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。胶束。p蛋白质蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。同分子之间原有的电荷差异。p与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键

15、打开，使蛋白质分子线性化。性化。 Western Blot蛋白质蛋白质-SDS-SDS胶束的特点：胶束的特点：（1 1）具有相同的形状，形状）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒像一个长椭圆棒（2 2）平均）平均1g 1g 蛋白质结合蛋白质结合1.4g SDS1.4g SDS（3 3）短轴对不同的蛋白质亚）短轴对不同的蛋白质亚基基-SDS-SDS胶束基本上是相同的胶束基本上是相同的（4 4）长轴的长度则与亚基分）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比子量的大小成正比 Western Blotq不连续的电泳缓冲体系。qSDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子

16、量的大小。 SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 Western Blot1.3 1.3 不连续电泳：不连续电泳： 作用作用缓冲液缓冲液PHPH凝胶浓度凝胶浓度浓缩胶浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris-Cl低，2-5%分离胶分离胶使蛋白样品分离pH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小电泳缓冲液：电泳缓冲液：pH8.3 Tris-pH8.3 Tris-甘氨酸系统甘氨酸系统。 Western Blot凝胶浓度（）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS-PAGE浓缩胶浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方及分离胶配方表：表：

17、http:/ Western Blot1.5 SDS-PAGE凝胶配制凝胶配制 l配制相应浓度的配制相应浓度的SDS-PAGE分离胶，分离胶，TEMED加入后迅速混匀制胶，沿壁迅速灌注分离胶溶液，留出积层胶所需空间（梳齿长再加1cm）。覆盖5mm水(或异丙醇）层于分离胶溶液上，约30-60min后分离胶和水层之间会出现清晰界面，表明分离胶充分聚合（可微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合）。 ddH2O轻轻洗涤凝胶顶部数次，以除去未聚合的凝胶，再用滤纸吸净残留液体，注意不要接触胶面。灌制分离胶灌制分离胶 Western BlotSDS-PAGE凝胶配制凝胶配制 l覆盖层可保持胶面平整和防止空覆盖层可保

18、持胶面平整和防止空气进入，因为氧气扩散进入凝胶会气进入，因为氧气扩散进入凝胶会抑制聚合反应。抑制聚合反应。l灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。l胶浓度胶浓度10%时可用时可用0.1%的的SDS封，浓度封，浓度10%时用水饱和的异丁时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用醇或异戊醇，也可以用0.1%的的SDS。封胶后切记，勿动。 ddH2O0.1%SDS:8%隔绝空气隔绝空气 Western Blot灌制积层胶灌制积层胶 插入梳子插入梳子 凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一

19、没有气泡；积层胶与分离胶界面要水平；AP和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。 Western BlotStaking gelSeparating gel注意事项：注意事项：1.1.抗原样品与缓冲液混合水浴加热时不要进水！最好采用空气浴；抗原样品与缓冲液混合水浴加热时不要进水！最好采用空气浴；2.2.电泳电泳BufferBuffer最好不要重复利用，因为样品比较珍贵，而电泳液相对廉价；最好不要重复利用，因为样品比较珍贵，而电泳液相对廉价；3.Buffer3.Buffer一定要漫过梳子孔，一定要漫过梳子孔，否则就会发现蛋白跑不动；否则就会发现蛋白跑不动；

20、4.4.电泳时先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，电泳时先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白。慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白。 Western Blot2.转膜p要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法毛细管印迹法和电泳印迹法。p常用的电泳转移方法有湿转和半干转湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。 Western Blotp最常用于最常用于Western Blot的转移膜主要

21、是硝酸的转移膜主要是硝酸纤维素（纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟）膜和聚偏二氟乙烯乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，）膜，此外也有用尼龙膜、此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似膜的特点相似,主要用于主要用于核酸杂交。核酸杂交。p各种膜的详细特点介绍：各种膜的详细特点介绍：phttp:/ Western Blot Western Blot膜的选择主要根据：膜的选择主要根据：na.a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的

22、膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；小）；nb.b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；法，信噪比好）；nc.c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。 Western Blot湿转系统 Western Blot半干转移系统 Western Blot 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水

23、几次。只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。印度墨汁不能和化学发光物合用，若是使用呈色反应的酶检测法时，印度墨汁的黑色会使凝胶难于拍照。 Western Blot一般封闭条件为：室温或者 37缓慢摇荡12h，特殊情况也可 4过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。比如有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。 封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。洗涤液使用TBST 或者PBST。 Western Blot一抗、二抗孵育p把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm

24、2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。p回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。p加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 p回收二抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。p最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。 Western Blot辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法(HRP) Western Blotn碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的产物；n辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑TMB氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色

25、产物。n另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺(luminol，氨基苯二酰一肼)并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。 Western Blotl HRP标记二抗用DAB显色，按顺序依次将DAB三种剂各取3滴于5ml蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显色液中避光显色5-15min终止反应，对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存l AKP标记二抗用AP显色，在10mlAKP缓冲液中加入66µlNBT溶液和33µl

26、 BCIP溶液混匀，室温下将膜放入显色（37可加速反应）5-15min。对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。l底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。（荧光在一段时间后会越来越弱，要控制好时（荧光在一段时间后会越来越弱，要控制好时间）间） Western Blot膜解吸方法（膜的重复利用）膜解吸方法（膜的重复利用） p通过加热和去污剂进行解吸通过加热和去污剂进行解吸 原理：原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离，适用于任何化学发光底物系统。p酸解吸酸解吸

27、原理：原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任何化学发光底物系统。蛋白样品非常宝贵，可以使用蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。 Western BlotWestern Blot结果分析p目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。p在Western Blot中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可

28、以用于校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。p此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。 Western Blot常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白作内参。 为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：对照分为：l阳性对照阳性对照（最好有标准品（比如-actin，GAPDH）或阳性血清）；l阴性对照阴性对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）；l空白对照空白对照（不加一抗

29、，用PBS代替）；l无关对照无关对照（用无关抗体）。 Western Blot成功进行 Western Blot 检测，设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到 Western Blot 的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如一般需要设置的对照如下：下：u阳性对照：阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率；u阴性对照：阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性；u二抗对照：二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性；u内参对照：内参对照：检测标本的质量和二抗系统；u空白对照：空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果 Western Blot Western Blot Western Blot Western Blot？ Western Blo