ChIP 原理及实验方法

1、染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验方法实验原理染色质免疫沉淀技术（ChIP）通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。ChIP技术最大的优点就是在活体细胞状态下研究了蛋白质和目的基因结合状况，减少了体外实验的误差。在活体细胞中，先对与调节蛋白结合的染色质进行分离，然后通过一定的方法（例如：超声波）随机剪切染色质，用调节蛋白的抗体沉淀目的染色质，再通过一定手段把目的染色质上的蛋白质去除掉，最后用PCR等方法检测鉴定共沉淀的DNA片段的特性。仪器和试剂真空设备、涡旋器、液氮、冷冻离心管、离心机、超声波粉碎仪、miracloth37%甲醛，2M甘氨酸，ddH2O，剪

2、切的鲑精DNA/protein A琼脂糖珠(Sant cruz)，蛋白酶K（14mg/ml）,RNaseA,酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）,氯仿,无水乙醇,提取缓冲液1（EB1）:0.4M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；5mM -ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（aprotinin、pepstain A、Leupeptin、Antipain、TPCK、Benzamidine） 提取缓冲液2（EB2）:0.25M 蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；10mM MgCl2；1%Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)；5mM -ME；0.1mM PM

3、SF；蛋白酶抑制剂混合物（同上）提取缓冲液3（EB3）：1.7M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；0.15%Triton X-100；2mM MgCl2；5mM-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上）核裂解缓冲液（NLB）：50mM Tris-HCl，pH8.0；10mM EDTA；1%SDS；PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（同上）ChIP稀释缓冲液（ChIP DB）：1.1%Triton X-100；1.2mM EDTA；16.7 mM Tris-HCl，pH8.0；167mM NaCl；PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（同上）洗脱缓冲液（EB）：1%SDS；0.1M

4、NaHCO3（现配）低盐洗脱液：150mM NaCl；0.1%SDS；1%Triton X-100；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0高盐洗脱液：500mM NaCl；0.1%SDS；1%Triton X-100；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0LiCl洗脱液：0.25M LiCl；1%NP-40；1%脱氧胆酸钠；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0TE缓冲液：1mM EDTA；10mM Tris-HCl，pH8.0实验方法植物材料的准备（以拟南芥为例）1在覆盖有保鲜膜的土里播上拟南芥的种子。2约3周后，在50ml管中收集1.5

5、g的幼苗，无菌水洗2次。甲醛固定4室温下把幼苗浸在37ml 含1%的甲醛的EB1液中，抽真空10min。5加入2M甘氨酸使终浓度至0.125M，中止反应，继续抽真空5min，此时幼苗应该变为半透明。(加2M甘氨酸约2.5ml)6用40ml水洗幼苗3-4遍。7去除幼苗水分，将幼苗液氮冷冻-80保存或继续进行下面操作。分离和超声染色质（注：除特殊注明，所有操作都在4进行）8液氮预冷研钵和杵子，液氮研磨幼苗成粉末状。9在50ml管中加入30ml EB1悬浮组织。(此时，EB1中不含甲醛)104层miracloth过滤组织到一个新的50ml管中。114，2880g离心20min。12小心去上清，1ml

6、 EB2重悬沉淀。13转移至一个新的1.5ml离心管。144，12000g离心10min。15300ul EB3重悬沉淀。16转入另一已加入300ul EB3新管中。174，16000g离心1小时。18去上清，300ul NLB重悬沉淀（4操作），涡旋，用枪头吹打，保留10ul溶液做后续检测。（在上胶前，该溶液按下面DNA解交联的操作步骤一样）19超声波处理溶液，打断DNA成约0.5-2kb的DNA片段。打断的染色质可以-80保存，或进行后续操作。免疫沉淀204，16000g离心5min沉淀碎片。21转移上清到一个新管。保留10ul溶液去检测超声效率（按第35步往后处理）做后续检测 (以第18

7、步保留的溶液做对照，电泳检测DNA片段的长度)。22分200ul到2个新管，每管100ul。23每管加900ul ChIP稀释液，使SDS浓度变为0.1%SDS。24每个样品加440ul剪切的鲑精DNA /蛋白A琼脂糖珠（用前，珠必须洗3次，然后重悬于ChIP稀释液中），4，轻轻晃动1小时。（注：鲑精DNA /蛋白A琼脂糖珠的用量需要根据购买的产品质量进行调整）254，16000g离心2min。26合并2管上清（约2ml），分装2ml到3个EP管中（每管666ul）。27加4ul抗体到其中的2管中，另一管作为阴性对照。284过夜，并轻轻晃动。29再加440ul剪切的鲑精DNA /蛋白A琼脂糖珠

8、（事先用ChIP稀释液洗涤处理），4轻微晃动1小时，收集免疫沉淀。30准备新鲜的洗脱缓冲液（1%SDS，0.1M NaHCO3，现配）。314，16000g离心2min，取沉淀，每次1ml洗脱液洗沉淀10min。洗脱液顺序如下：（1） 低盐洗脱液1次（2） 高盐洗脱液1次（3） LiCl洗脱液1次（4） TE缓冲液2次最后，去除TE缓冲液。洗脱和染色质的解交联32加250ul新鲜的洗脱缓冲液（第30步已准备）到沉淀珠中，以释放和珠结合复合物。33混匀，65水浴15min，轻微晃动。34小心取上清转移到新管，重复洗涤珠，合并2次洗液。35加20ul 5M NaCl，65孵育过夜，以解染色质的固定

9、。36加10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris-HCl，pH6.5，和1.5ul 14mg/ml的蛋白酶K，65温育1小时。37等体积酚/氯仿抽提DNA，在有novagen pellet paint存在的情况下乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗沉淀。38用40-50ulTE缓冲液（含10ug/mlRNase A）溶解DNA。纯化的DNA片段可用于PCR扩增检测目的基因，或者可用多重PCR来鉴定目的基因的有无（与内参对照）。39在25ulPCR体系中，模板加0.5ul。模板的变化依赖于免疫沉淀的效果。附：剪切的鲑精DNA /蛋白A琼脂糖珠混合物（1M Tris-HCl，pH6.5；5M

10、NaCl；0.5M EDTA，65加热封闭）（玻璃珠规格：212- to 300-um diameter; sigma）制备方法：1 制备100ml灭菌TE（10 mM Tris，pH 8.0；1 mM EDTA，pH 8.0）2 结合：50mgBSA（做稀释抗体用）；0.5ml叠氮化钠（从5%的储存液中吸取），补充TE到47.5ml，0.2 u 滤膜过滤（溶液II）。3 用15ml灭菌TE洗20ml蛋白A珠（50% slurry）2次。4 结合：10ml protein A，4mg剪切的ssDNA，20ml灭菌的溶液II，4振摇45分钟。5 分装4保存注意事项：1材料固定要充分，使其全部沉到

11、底部。抽气后在冰上固定半小时，固定时间勿太长，否则可能会影响之后的抗体结合。216步中重悬物轻轻滴加在另一新管中的EB3上。319步中超声条件根据不同材料调整，如100W, 超声10秒，间隔15秒，超声4次。424步中洗蛋白A琼脂糖珠时可将琼脂糖珠轻轻弹开，混合均匀，以便充分洗涤。531步中洗脱过程中也要轻轻弹开琼脂糖珠。参考文献：Chris Bowler, Giovanna Benvenuto, Pierre Laflamme, Diana Molino, Aline V. Probst, Muhammad Tariq and Jerzy Paszkowski，Chromatin techn

12、iques for plant cells，The Plant Journal (2004) 39, 776789染色质免疫沉淀（ChIP）技术的难点及应用柴晶晶博士序言随着人类基因组测序工作的基本完成，功能基因组学的研究逐渐成为研究的热点。而基因表达的调控又是功能基因组学的一个重要研究领域。研究某个蛋白因子的调控功能，可以通过对蛋白活性（激活或抑制其活性），蛋白数量（过表达Overexpression或基因缺陷型Knockout）, 以及蛋白功能（功能缺陷型蛋白Dominant-negative mutation）的控制，影响下游基因的表达，而下游基因的变化又可以通过基因芯片（cDNA Mi

13、croarray），抑制消减杂交（Suppression Subtractive Hybridization），差异显示RT-PCR等方法进行研究1。然而这些方法都无法提供证据证明这些变化是受某个蛋白因子直接调节的，还是间接的其他变化导致的结果。所以，要想提供蛋白因子直接调控的证据，就要直接检测蛋白质-DNA的相互作用。传统的方法包括转录因子结合实验（Transcription Factor Assay），电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay），DNase I 足印法（DNase I footprinting），酵母单杂交系统等。但这些方

14、法都有一定的局限性，不能充分反映生理情况下DNA与蛋白相互作用的真实情况，而且很难捕捉到在染色质水平上基因表达调控的动态瞬时事件2。染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，简称ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。特别是近年来由于该技术不断的发展和完善，其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用，发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用；从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用，发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用；从研究启动子区域的组

15、蛋白的修饰，发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。随着对基因功能研究的不断深入，这项技术正越来越多的被应用于科研的各个领域。目前已经有成熟的ChIP试剂盒出售，如Millipore公司提供的EZ-ChIP试剂盒，使得越来越多的研究者更容易地采用染色质沉淀技术在许多研究领域取得了成功。ChIP技术的原理染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定

16、。因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。对于刚刚开始使用ChIP技术的研究人员来说，使用成熟的商品化试剂盒和相关的技术服务会达到事半功倍的效果，比如Millipore公司的EZ-ChIP试剂盒就是专门为初学者设计的入门产品。下面我们就最基本的实验步骤，实验中的小技巧以及需要注意的问题简单介绍一下。1.细胞固定甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终

17、浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。值得注意的是，交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。2.染色质断裂交联后的染色质可被超声波或Micrococcal Nuclease切成400600 bp的片段（用琼脂糖凝胶电泳检测），以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低

18、温。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。Micrococcal Nuclease可以将染色质切成一到几个核小体，比超声波处理的结果更精致，更均一（图1）。另外，酶反应的条件比较温和，对DNA和DNA-蛋白复合物的损伤较小，而且蛋白不易变性。酶处理染色质适用于新鲜的细胞或组织样品和冰冻样品。在研究组蛋白时，经常采用没经过甲醛固定的Native ChIP（N-ChIP）的研究方法。因为N-ChIP没经过甲醛固定，超声波处理会打断组蛋白和DNA的结合，所以只能选择酶处理染色质的方法。对于甲醛固定的样品，一般选择超声波处理方法。也有研究人

19、员使用酶处理的方法研究甲醛固定较温和的样品。Millipore公司有商品化的Micrococcal Nuclease处理的ChIP试剂盒（EZ-Enzyme）提供。1.染色质免疫沉淀Input对照：在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。Beads选择：接下来，利

20、用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合物，然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此复合物，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段。再经过多次洗涤，除去非特异结合的染色质后，用SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合物。Magna beads是近年来出现的一种新型beads，它使用方便，不像Agarose beads那样容易破裂，所以在操作过程中更简单，而且免去了离心的步骤，节省不少时间。Millipore公司最新推出的Magna ChIP试剂盒就是采用这种Magna beads。抗体选择： 染色质免疫沉淀所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功

21、的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近，不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物，直接影响ChIP的结果。所以不是所有的抗体都能做ChIP实验的，只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性，比如Millipore公司的ChIP Validated抗体等。阳性与阴性对照：在做ChIP实验时，一定要做好实验对照，因为没有对照，很难对实验结果的可靠性进行评估。阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体，常用的包括组蛋白抗体或RNA Polymerase II抗体等。阴性抗体通

22、常选择目的蛋白抗体宿主的IgG或血清。目的蛋白抗体的结果与阳性抗体和阴性抗体的结果相比较，才能得出正确结论。另外，还应考虑目的蛋白抗体与DNA的非特异性结合的可能，所以通常还会选择一对阴性引物，即目的蛋白肯定不会结合的DNA序列，作为该抗体的阴性对照。最佳的阴性对照引物是在靶序列上游的一段与目的蛋白肯定不能结合的序列。如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉淀实验的抗体，只有其他用途的抗体时，可以先做蛋白质免疫沉淀（Immunoprecipitation）检测。如果抗体可以成功的沉淀蛋白，再进行染色质免疫沉淀实验的检测。2.交联反应的逆转和DNA的纯化用不含DNase的RNase和Prote

23、inase K，65oC保温6小时逆转交联，经DNA纯化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA。DNA纯化柱纯化DNA的质量高，有利于下一步PCR等方法的检测。因为甲醛不仅交联DNA-蛋白质，还交联蛋白质-蛋白质，所以还可以对DNA序列上的蛋白质复合物进行分析。在逆转交联时不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有机相中的蛋白质，进行分析。3.DNA的鉴定最常用的DNA的鉴定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于启动子区域的序列具有多样性的特点，所以不同的细胞系或不同的动物品系的同一基因的启动子序列有可能不同。而且启动子区域多富含CG的序列，其PCR条件可能需要相应

24、调整。有条件可设计不止一对引物来反复验证ChIP实验的结果（图2）。ChIP技术的应用染色质免疫沉淀的DNA适用于多种分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要验证的，可采用狭缝杂交（Slot blot）的方法，把靶序列特异性探针与染色质免疫沉淀的DNA杂交，来验证目的蛋白与DNA靶序列的特异性结合。还可以根据靶序列设计引物，用半定量PCR的方法进行测定，或采用Real-time PCR方法进行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的（high-throughput），可采用Southern杂交。但因为免疫沉淀的DNA量较少，所以在研究时通常要用PCR方法扩增DNA探针，再进行整个基

25、因组扫描。还可以把沉淀的DNA克隆到载体中，进行测序，寻找该序列附近的开放阅读框，发现新的基因调节序列。目前，随着人类基因组测序工作的基本完成，研究目的蛋白和整个基因组的相互作用逐渐成为研究的热点。由于基因组中的信息量非常大，上述常规方法通常无法满足科研的需要。近年来发展起来的ChIP-chip技术将基因组DNA芯片（chip）技术与染色质免疫沉淀技术（ChIP）相结合，为研究目的蛋白与整个基因组相互作用提供了可能。ChIP-chip 技术通过标记染色质免疫沉淀富集的DNA片段，和另一个被标记不同探针的对照组样品一起，与DNA芯片杂交，再利用各种生物信息学方法对收集到的信号进行分析，具体的实验

26、步骤请参考Dr. Richard Young在Nature Protocols上的文章3。ChIP-chip技术已经被广泛应用于研究转录因子在整个基因组中的信号网络4, 5, 6，染色质修饰机制在基因组中的调控7, 8，DNA的复制，修复以及修饰9, 10，基因的转录与核运输11, 12, 13等诸多方面。染色质免疫沉淀技术还可用于分析两种蛋白共同结合的DNA序列，即ChIP reChIP方法。ChIP reChIP是在第一次ChIP的基础上不解交联，而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀，从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。值得注意的是，因为通过两次免疫沉淀富集的DNA量比较少，所以在分析

27、时通常要把多次免疫沉淀的DNA浓缩后再进行操作。随着染色质免疫沉淀技术受到广泛的关注，运用该技术发表的文章也逐渐增多，大家越来越多的开始关注如何改进ChIP的方法。Millipore最新推出的Magna ChIP试剂盒，利用磁珠分离DNA-蛋白-抗体复合物，提高了ChIP的效率，简化了操作的过程，缩短了实验的时间，还为同时进行多个目的蛋白的研究提供了可能，是经常使用ChIP技术的研究人员的理想选择。近年来ChIP技术也被用于研究RNA-蛋白的相互作用，其原理与DNA类似，也包括甲醛固定，超声波破细胞，免疫沉淀，交联逆转，RNA纯化和RNA鉴定等步骤。所不同的是，交联逆转只用Proteinase

28、 K，要进行RNA纯化和不含RNase的DNase处理，分析时用RT-PCR，芯片杂交要用cDNA芯片等13, 14。更多的参考资料请见参考文献1.王春雨，石建党，朱彦，张琚。染色质免疫沉淀技术在研究DNA与蛋白质相互作用中的应用。遗传HEREDITAS (Beijing), 27(5): 801, 2005.2.Im H, Grass JA, Johnson KD, et al. Measurement of protein-DNA interaction in vivo by chromatin immunoprecipitation. Methods Mol. Biol., 284: 1

29、29, 2004.3.Lee T. I., Johnstone S.E., Young R.A., Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nat. Protocols, 1, 729-747, 2006.4.Nal B., Mohr E., Ferrier P. Location analysis of DNA-bound proteins at the whole-genome level: untangling transcriptional regulatory n

30、etworks. Bioessays 23, 473-476, 2001.5.Hanlon S.E., Lieb J.D. Progress and challenges in profiling the dynamics of chromatin and transcription factor binding with DNA microarrays. Curr. Opin. Genet. Dev. 14, 697-705, 2004.6.Banerjee N., Zhang M.Q. Identifying cooperativity among transcription factor

31、s controlling the cell cycle in yeast. Nucleic Acids Res., 31; 7024-7031, 2003.7.Carter N.P., Vetrie D. Applications of genomic microarrays to explore human chromosome structure and function. Hum. Mol. Genet. 13 (Spec No 2), R297-R302, 2004.8.Van Steensel B., Henikoff S. Epigenetic profiling using m

32、icroarrays. Biotechniques, 35, 346-357, 2003.9.MacAlpine D.M., Bell S.P. A genomic view of eukaryotic DNA replication. Chromosome Res., 13, 309-326, 2005.10.Woodfine K., Carter N.P., Dunham I., Fiegler H. Investigating chromosome organization with genomic microarrays. Chromosome Res., 13, 249-257, 2

33、005.11.Lei E.P., Krebber H., Silver P.A. Messenger RNAs are recruited for nuclear export during transcription. Genes. Dev., 15, 1771-1782, 2001.12.Ishii K., Arib G., Lin C., Van Houwe G., Laemmi U.K. Chromatin boundaries in budding yeast: the nuclear pore connection. Cell, 109, 551-562, 2002.13.Rodr

34、iguez-Navarro S. et al. Sus1, a functional component of the SAGA histone acetylase complex and the nuclear pore-associated mRNA export machinery. Cell, 116, 75-86, 2004.14.Nitranjanakumari S., Lasda E., Brazas R., Garcia-Blanco M. A. Reversible cross-linking combined with immunoprecipitation to study RNA-protein interactions in vivo. Methods, 26(2); 182-190, 2002.15.de Silanes I L., Zhan M., Lai A., Y