大鼠视网膜急性光损伤后一氧化氮合酶阳性神经元的改变

1、    大鼠视网膜急性光损伤后一氧化氮合酶 阳性神经元的改变        【关键词】视网膜；光损伤；一氧化氮合酶；一氧化氮中分类号：R774.1R329.33文献标识码：B文章编号：1005-1015(2000)03-0209-02一氧化氮(nitric oxide,NO)作为一类新发现的神经递质，在神经系统中发挥了重要的信使作用。此外，在某些情况下，NO具有一定的神经毒性作用，可导致神经元变性1。视网膜光性损伤也表现为神经元变性过程。我们用NADPH黄递酶组织化

2、学染色法研究了大鼠视网膜急性光损伤后一氧化氮合酶阳性神经元的变化，以探讨NO在视网膜急性光损伤发病机制中的作用。1材料和方法11动物30只成年SD雌性大鼠(由同济医科大学医学动物实验中心提供)，体重200250 g，其中6只为对照组，其余24只为实验组，均饲养在正常昼夜环境中。12视网膜急性光损伤模型实验组24只大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)全麻，以托吡酰胺散大瞳孔，用手术显微镜(YZT型，苏州医疗器械厂，15 V，150 W)垂直照射大鼠瞳孔，分别照射左右眼100 min，角膜平面照度为14 000 lux(JD-IA型照度计，上海嘉定学联仪表厂)。光照后1、3、7、14 d

3、各处死6只大鼠，2只摘取眼球作病理组织切片，另外4只摘除眼球后分离视网膜作NADPH黄递酶组织化学染色。13病理切片大鼠断头处死后，立即摘除眼球，作常规病理切片，HE染色，光镜下观察。14视网膜NADPH黄递酶染色大鼠以4%多聚甲醛溶液心脏灌注固定后，立即摘除眼球，置入4%多聚甲醛溶液15 min，剥离视网膜，于4%多聚甲醛溶液后固定1 h，再移入0.1 M 磷酸缓冲液(PB，pH=7.4)中漂洗5 min后，将视网膜移入孵育液中进行NADPH黄递酶染色反应。孵育液为1 ml 0.1 MPB中含5 l曲拉通X-100(Triton X-100,Sigma公司)，1 mg NADPH(Boehr

4、inger Mannheim公司)，0.5 mg氯化硝基四氮唑蓝(NBT，上海前进试剂厂)。37下孵育3 h，移入0.1 MPB中漂洗5 min，将视网膜平铺于经APES处理过的载玻片上，室温干燥，常规脱水透明，树胶封片。光镜下随机测量每400倍视野内一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS）阳性神经元的数目，取其平均数，以t检验进行统计学处理。2结果21病理切片观察视网膜急性光损伤后，光感受器内外节严重破坏，外核层细胞核数目明显减少，色素上皮及神经节细胞也不同程度受损。且随时间延长，光损伤的程度加重。22NADPH黄递酶染色观察NOS阳性神经元散在分布，胞体呈圆形或卵

5、圆形，并可见较长的树突。光照后1、3、7d组NOS阳性神经元分布密度增加，分别为每400倍视野(10687 3±1.196 9)个，(10.172 3±0.815 8)个，(9.761 5±0.840 2)个，与正常对照组每400倍视野(8.743 7±0.994 9)个比较差异有显著性。但14d组每400倍视野(9.2730±0.8985)个与对照组比较差异无显著性。3讨论视网膜光损伤机制极其复杂，目前认为主要由光化学损伤所致。NO是一种自由基性质的气体，它参与机体多种生理和病理过程之中。内源性NO由左旋精氨酸(L-arginine,L-Ar

6、g)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化下产生。用NADPH黄递酶组织化学染色可反映NOS在神经系统内的分布情况，并间接了解NO的水平2，一般来说，当机体内NOS维护在低水平的持续表达状态时，含NOS的部位NO可维持在低浓度发挥生理功能。一旦机体受刺激后NOS表达增加，可产生大量的NO，而高浓度的NO具有细胞毒性作用3。视网膜中的NOS阳性神经元主要为内核层的无长突细胞和节细胞层的移位无长突细胞4,5，视网膜内的NO参与血液循环的调节6及视觉信息的传递7。但在某些病理状态下，视网膜内NOS表达可能增加，产生过量的NO，对视网膜组织具有毒性破坏作用。自发性高血

7、压大鼠视网膜内一氧化氮合酶表达增加，提示NO在视网膜缺氧缺血的情况下，可能参与神经细胞损伤的过程8。用NOS抑制剂可减轻视网膜的缺血性损伤则从反面证实了NO对视网膜的毒性作用9。本实验结果提示，NO可能作为一种内源性的神经毒性因子参与视网膜急性光损伤。大鼠视网膜急性光损伤后1、3、7 d组视网膜中NO阳性神经元分布密度较正常对照组显著增加。因此，在大鼠视网膜急性光损伤早期，NOS表达增加，从而释放过量NOS作用于视网膜组织，造成光感受器细胞、神经节细胞的变性坏死。在这一过程中，羟自由基(OH*)可能起重要作用。视网膜在强光持续照射之下，视网膜中所含的视紫红质吸收光子，可激发电离，产生大量自由基

8、。这些自由基可能与NO结合生成更具毒性的羟自由基，加重对视网膜的损伤，14 d组NOS阳性神经元无明显改变，提示在大鼠视网膜急性光损伤晚期，NO可能不参与视网膜的损伤。但在本实验中光损伤程度随时间延长而加重，与NOS阳性神经元改变并不一致，可能由于视网膜光损伤机制极其复杂，NO途径仅仅是其中一个环节，其确切地位还需进一步探索。作者单位：刘晓强（430022 武汉，同济医科大学附属协和医院眼科）丁正平（430022 武汉，同济医科大学附属协和医院眼科）吕源淑（430022 武汉，同济医科大学附属协和医院眼科）4参考文献1，Dawson VL,Dawson TM,Bartley,DA,et al.

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