双水相萃取技术在生物活性物质分离提纯中的研究进展

1、双水相萃取技术在生物活性物质分离提纯中的研究进展摘要：双水相萃取技术作为一项新的分离技术日益受到重视,它与传统的萃取方法相比有独特的优点。本文将简要综述双水相萃取技术的基本原理、在分离提纯生物物质中的应用情况以及今后的发展方向。关键词：双水相萃取；生物活性物质；分离提纯Separation and Purification of Bioactive Substances in Aqueous Two-phase Extraction in ProgressName: Chen Zhi-bin Student ID: 201011130798 Professional: Biological C

2、hemical Class: 13 classesAbstract: Aqueous Two-phase Extraction technology has received increasing attention as a new separation technology, which is compared with the traditional extraction methods has unique advantages. This article will briefly summarize two-phase extraction technology through th

3、e basic principle of separation ， purification of biological substances in the application and future development direction. Key words: aqueous two phase extraction; biologically active substances; separation and purification朗读显示对应的拉丁字符的拼音 字典 - 查看字典详细内容随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程代谢工程等高新生物技术研究工作的广泛展开各种生

4、化新产品不断涌现，但由于大部分的生物产品原液是具有低浓度和生物活性的，对分离条件以及环境要求极其苛刻，使得传统的液液萃取已不能适应分离要求，因此一种新型的液液分离技术双水相萃取技术双水相萃取应运而生。双水相萃取(Aqueous TwoPhase Extraction，ATPE技术是为适应生物工程的迅猛发展，于六十年代首先由瑞典的PAAlbertson等提出的。近年，双水相萃取技术因设备投资少，操作简单，引起了人们极大的重视，并且被广泛用于生物化学，细胞生物学和生物化工等领域1，涉及到细胞、膜、病毒、蛋白质、核酸以及其他天然药物有效成分的分离及提纯2。由于它具有活性损失小、分离步骤少、操作条件温

5、和，且不存在有机溶剂残留的问题等优点，所以在生物活性成分及天然产物有效成分的提取分离方面有良好的应用前景。1. 双水相萃取相关理论的发展早在1896年,Beijerinck发现,当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个混浊不透明的溶液，随之分为两相,上相富含明胶,下相富含琼脂(或淀粉, 这种现象被称为聚合物的不相溶性，从而产生了双水相体系(Aqueous two phase system，ATPS。1955年由Albertson首先利用两水相技术分离生物分子，他主要研究了聚乙二醇(PEG/葡聚糖(Dex系统和PEG/(NH42SO4系统在分离提纯中的应用。在随后的几十年中，这项技术有

6、了长足的发展。在双水相的分离模型研究中，主要提出了两类模型3，4，Edmond等人提出的渗透维里模型，即Edmond bgston方程；Flory和Huggins根据热力学的基本原理提出FloryHuggins晶格模型。前者在预测聚合物的成相行为和蛋白质的分配上有较高的准确度，后者在粒子的能量概念上可以很好地拟合实验数据。自20世纪80年代中期以来，各国学者开展了进一步的研究工作，各类用于计算生物物质在双水相系统分配系数的模型也时有报道,诸如Baskir晶体吸附模型5、Hayne模型、Pitzer模型6、Grossman自由体积模型等,但结果均难以令人满意。1989年,Diamond等7以Fl

7、ory Huggins理论为基础,用把相间电势表达为上下相浓度差的二次函数来关联分配系数的方法,提出了能对肽和蛋白质在聚合物/聚合物/水体系的分配系数很好关联的Diamond Hsu模型。此后,针对用该模型计算蛋白质在聚合物/盐两水相系统中的分配系数时精确度不高的缺点,Diamond等提出了改进的Dim ond Hsu模型，进一步提高了Diamond H su模型的精确度和普适性。Pessoa等8通过引入对聚合物水溶性和预分离物质(氨基酸、肽、蛋白质的水化壳进行描述的因子得到了FloryHuggi改进模型，此模型很好地模拟了73种由PEGDex组成的双水相体系的相平衡和分配系数。虽然双水相萃取

8、技术在应用方面取得了很大进展，但目前这些工作几乎都只是建立在实验数据的基础上，至今还没有一套比较完善的理论来解释物质在体系中的分配机理。2.双水相萃取技术基本原理1.1双水相的形成将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然地分成互不相溶的两相。双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离倾向也就越大。与一般的水有机溶剂体系相比较，双水相体系两相的性质差别(如密度和折射

9、率等较小。由于折射率的差别甚小，有时甚至都难于发现它们的相界面。两相间的界面张力也很小，仅为10-610-4N/m(一般体系为10-310-2N/m。界面与试管壁形成的接触角几乎是直角。原则上，无论是天然的还是合成的亲水性聚合物，绝大多数在与另一种聚合物水溶液混合时都可分成两相，构成双水相体系部分双水相系统列于表1。用于生物分离的高聚物体系有:聚乙二醇(简称PEG/葡聚糖(简称Dexteran和PEG/Dextran硫酸盐体系。常见的高聚物/无机盐体系为:PEG/硫酸性或磷酸盐体系。表1各种双水相系统聚合物1 聚合物2或盐 聚合物1 聚合物2或盐聚丙二醇 甲基聚丙二醇 聚乙二醇 聚乙烯醇聚乙二

10、醇 聚乙烯吡咯聚乙烯醇 烷酮聚乙烯吡咯烷酮 葡聚糖羟丙基葡聚糖 聚蔗糖葡聚糖乙基羟乙基纤维系 葡聚糖 羟丙基葡聚糖 葡聚糖聚丙二醇 硫酸钾 聚乙二醇 硫酸镁聚乙二醇 硫酸铵聚乙烯吡咯烷酮 硫酸钠甲氧基聚乙二醇 甲酸钠酒石酸甲钠甲基纤维素 甲基纤维素 葡聚糖聚乙烯醇或葡聚糖 羟丙基葡聚糖聚乙烯吡咯烷酮 羟丙基葡聚糖1.2萃取原理9双水相萃取与水有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的

11、条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化之目的。物质在双水相体系中分配系数K可用下式表示： K= C上/ C下 其中K为分配系数，C上和C下分别为被分离物质在上、下相的浓度。 分配系数K等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的K值不同,可利用双水相萃取体系对物质进行分离。其分配情况服从分配定律，即“在一定温度一定压强下，如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里，达到平衡后，该物质在两相中浓度比等于常数”，分离效果由分配系数来表征。 3. 双水相萃取的应用双水相萃取技术已广泛应用于生物化学、细胞生物学、生物化工和食品化工等领域，并取得了许多成功的范例，主要是分离蛋白质 ，酶，病毒，

12、脊髓病毒和线病毒的纯化，核酸，DNA的分离，干扰素，细胞组织，抗生素，多糖，色素，抗体等。下面就生物活性物质的应用进行阐述。3.1在发酵工程中的应用由于发酵液中成分比较复杂，目标产物含量低，而传统的分离纯化方法步骤繁琐，导致产品回收率低，成本居高不下。目前国内外已经有利用双水相休系从发酵液萃取分离目标产物的报道和研究，并取得了一些成绩。Pan等10利用PEG 1500/NaH2PO4体系从Trichoderma koningi i发酵液中分离纯化木糖苷酶，该酶主要分配在下相，下相酶活回收率96.3%，纯化倍数33。M aria等11利用PEG1000/NaH 2PO4体系从Fusarium s

13、olanipisi发酵液中分离纯化角质酶，该酶主要分配在上相，酶活回收率91%，纯化倍数4.1。Mirjana12利用PEG 4000/Dex体系从Polypor ussquamosus发酵液中分离果胶酶，该酶主要分配在上相，酶活回收率80.2%，纯化倍数2.45。Martinha13利用PEG 8000/(NH 42SO4体系从K l uy v er omy cesmar x i anus发酵液中分离胞外多聚半乳糖醛酸酶，该酶主要分配在上相，酶活回收率91%，纯化倍数19。冯菁等14采用质量分数8%的PEG4000、质量分数为13%的Na2 SO4和质量分数为6%NaCl组成的双水相直接从重

14、组巴氏毕赤酵母发酵上清液中分离人溶菌酶，双水相萃取率达到96.63%，纯化因子为6.5。黄瑛等15采用质量分数10%的PEG 2000、15%的磷酸盐和1%的NaCl组成的双水相系统从洋葱假单细胞G 63发酵粗酶液中提取脂肪酶，当系统的pH为8.0时，分配系数4.36，纯化因子3.98，脂肪酶的回收率达到87.25%。3.2在药物方面的应用薛珺等16采用PEG 800与吐温80组合表面活性剂、硫酸铵、水形成双水相体系萃取芦丁，芦丁在该双水相体系的平均萃取率为95.0%。谢涛等17利用PEG 4000/K2HPO4组成的双水相体系从三七中萃取三七皂苷，三七总皂苷的分配系数为14.2，回收率为96

15、%；赵爱丽等18利用质K2 H PO4组成的双水相体系分离纯化黄苓苷，黄苓苷的分配系数达到29.8，收率达到98.6%。石慧等19利用质量分数25%PEG 400、质量分数为12%(NH42SO4和质量分数为3%NaCl组成的双水相体系从加杨叶萃取液中萃取加杨叶总黄酮，萃取率达到95%以上。朱自强等20用质量分数8%的PEG 2000与质量分数为20%的(NH 42 SO4组成的双水相系统直接处理青霉素G发酵液，分配系数高达58.39，浓缩倍数为3.53，回收率为93.67%。3.3在生物工程中的应用双水相技术作为一种生化分离技术，由于其条件温和，易操作，可调节因素多，并可借助传统溶剂萃取的成

16、功经验，而被认为是一种生物下游工程初步分离的单元操作。Babu21等用质量分数18%的PEG 1500与质量分数为14%的磷酸盐组成的双水相从菠萝中萃取菠萝蛋白酶和多酚氧化酶，菠萝蛋白的纯化倍数为4.0，酶活回收率达到22.8%，下相多酚氧化酶的纯化倍数为2.07，酶活回收率达到90%。Chet hana22等用PEG 6000与(NH 42SO4组成的双水相从甜菜根中萃取甜菜色素，质量分数为70%75%甜菜色素被萃取到上相，质量分数为90%以上的糖类被萃取到下相。Harve和Bajpai23利用PEG/Dex双水相系统分离纯化了假单胞杆菌胞内的立体专一性酒石酸脱氢酶。4. 双水相技术的发展趋

17、势244.1廉价新型双水相系统的开发目前双水相萃取技术走向工业化所需解决的最大问题是构成双水相成相系统组分的价格十分昂贵。为了解决这个问题，国内外进行了大量的研究，一方面用廉价的无机盐代替以往常用的昂贵的葡聚糖。硫酸钠、硫酸镁、碳酸钾等盐与PEG形成的双水相系统现已经大量用于萃取操作；另一方面开发可替代聚乙二醇和葡聚糖的高聚物。变性淀粉PPT、阿拉伯树胶、Pulluan的微生物多糖、糊精、麦芽糖糊精、乙基羟乙基纤维素等取代葡聚糖，乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟基纤维素等替代PEG，均取得阶段性的成果。此外，有利用临界胶束浓度下表面活性剂的特异自组织行为及良好的稳定性

18、形成的ATPS，此类ATPS分相依据的是胶束的形成，包括由非离子型表面活性剂组成的ATPS和由离子型表面活性剂组成的ATPS。这些由表面活性剂组成的ATPS与传统ATPS相比有含水量更高，两相更容易分离，表面活性剂用量很少且可循环利用等独特的优点。4.2亲和双水相萃取技术亲和吸附具有专一性强，分离效率高等特点。利用其特点，将亲和吸附与双水相萃取技术相结合，即对成相聚合物进行化学修饰。该体系不仅具有萃取系统处理量大、放大简单等优点，而且具有亲和吸附专一性强、分离效率高的特点。4.3生物转化与双水相萃取技术相结合在生物转化过程中，随着转化的产物量的增加，常会抑制生化过程的进行。因此，及时移走产物是

19、生化反应中的主要问题之一。将双水相系统与生物转化相结合，形成双水相生物转化，解决了生物转化过程中存在的产物抑制以及生物催化剂回收利用两方面的问题，为生物转化赋予了新的内涵。4.4双水相萃取与膜分离相结合利用中空纤维膜传质面积大的特点，将膜分离与双水相萃取相结合，可以大大加快萃取传质速率。利用膜将双水相体系隔开，可解决双水相萃取的乳化和生物活性物质在界面的吸附问题。因此，将膜分离同双水相萃取技术相结合，是解决双水相体系易乳化问题及加快萃取速率的有利手段。4.5双水相萃取与细胞破碎过程相结合利用高速珠磨机为设备，将细胞破碎和双水相萃取同时在珠磨机内进行。由于珠磨机内有良好的混合条件，PEG、无机盐

20、和水得到充分混合，形成均匀的双水相分散体系。经过珠磨机加工的匀浆直接用离心机分相，细胞碎片分配在下相，胞内产物分配在上相。这种方法不仅节省了萃取设备和时间，而且由于双水相对很多蛋白质具有保持活性的特点，可以避免胞内产物的损失。此外，国内外又相继开展了微重力双水相萃取、高速逆流双水相分配、双水相电萃取、温度诱导相分离双水相萃取等新技术的研究。5. 双水相萃取技术的局限和未来展望25目前，双水相萃取技术已被研究用于众多生物产品的分离提纯，并显示出众多其它分离技术不具备的优点，是一种应用前景广阔的新型生物分离技术。但是，要将这一技术开发应用到大规模生产过程，还有许多理论和实践方面的技术问题有待解决。

21、主要表现在如下几个方面。(1聚合物/聚合物构成的双水相体系具有良好的分离性能，但用于构造双水相体系的成相聚合物的价格都比较昂贵，对于一般的生物产品，分离成本过高，从经济上是不合理的。(2虽然通过选择适宜的双水相体系和操作条件，可获得被分离物质在两相间较大的分配系数和较高的纯化倍数，但目标产物与成相物质的分离比较困难。(3双水相体系界面张力较小，虽有利于提高传质效率，但是较小的界面张力会易导致乳化现象的产生，使相分离时间延长，分离效率降低。(4双水相体系中组分间的作用非常复杂，目前没有建立一套较为完整的理论和方法解释和预测物质在双水相体系中的相行为和被分配物质在两相中的分配行为。(5缺乏对双水相

22、过程的工程放大及设备方面的研究，在体系流体力学，相际间的传质，传递过程方面研究很少。研究的方法基本上还是通过实验的方法，研究的结果只是建立在实验的基础上，大部分情况下不能外延，缺乏对过程规律的认识。(6对双水相萃取工艺整体的集成优化研究还不足，对分离过程中产生的大量含成相物质的稀溶液，还没有找到一条科学合理的利用及处理途径，大量含盐或含成相组分的废水溶液难于回收及处理。虽然双水相萃取技术研究中还存在很多问题，但随着对双水相体系研究的不断深入，性能优良的新型成相物质不断发现以及相关技术的不断发展，这些方面的问题将会逐步获得解决。随着双水相萃取技术的不断完善,双水相萃取技术将成为一种生物活性物质分

23、离提纯的重要技术方法。参考文献1林强，霍清双水相体系萃取甘草酸盐的研究J中草药，2002，33(8：702-7043Fu ruya T,Iw ai Y,TanakaY,et al.M eas urem ent and correlat ion of part it ion coef ficient s of hydrolyt ic enz yi mes f or dext ran+poly(et hyl ene glycol+wat er aqeueou s t w oPhase syst em s at 20%J.Fluid PHase E qu ilbria,1995,110:115128

24、.4Flory P J.Principles of polymer chemist ryM.New York:Comell Press,1953.5Peng Q H,Li Z C,Li Y G.Experimen t s correlation and prediction of prot ein partit ion coef ficient inaqueou s t wo phasesystems containing PEG an d K 2 HPO 4 K H2 PO4J.Flu id Phase E qu ilibria,1995,107:303315.6Pitzer K S.The

25、rmodynamics of electrolyt es I Theoreti calbasi s and general equat ions equationsJ.PHys Chem.,1973,77:268277.7Doamond A D,H su J T.Fundament al st udies of biomolecule part iti on in aqu eous two phase systemJ.Biotechnology and Bioengi neering,1989,34:1 0001 014.8Pessoa F P A,M ohamed R S.A salvat

26、ion basedt herm odynamic model for aqueou s two phase syst em sJ.Braz.JChem Eng,2001,18(4:449458.9 徐长波,王巍杰. 双水相萃取技术研究进展J. 化工科技, 2009,17(2:7579.10Pan I H,Y ao H J,Li Y K.Eff ect ive exract ion and purif icat ion of xylosidase f rom t ri chod erma koni ng ii f erm ent ati oncult ure by aqueous t w o p

27、hase part it ioningJ.E nzyme an d M icrobial Techn ol ogy.2001,(28:196201.11M aria.Improved pu rificat ion prot ocol of a f u sar iu m solanipi sirecombinant cut inase by phase part it ionning in aqueoust w o phase syst ems of poly et hylene glycol and phosp hat eJ.Enzyme and M icrob ial Techn ol og

28、y,1996,(18:251260.12M irjan a G A.Part iti on ing of pect inase produced by Poiyporu s squamosus in aqueou s t w o Phase sy st em polyet hyl eegl ycol 4000/crude dex t ran at dif f erent init ial pH valu lesJ.Carb ohydrat e Polymers,2004,(56:295300.13Wu Y T,Pereira M,V enancio A.S eparat ion of endo polyglact uroll as e u sing aqu eous t w o phase part it ioningJ.J ounral of Chromat ogra PH y A,2001,(929:2329.14冯菁,夏杰,等.人溶菌酶的双水相萃取法分离J.华东理工大学学报(自然科学版,2006,32(12:1 4091 412.15黄瑛,尹利,闫云君.双水相萃取法分离纯化洋葱假单细胞菌G63脂肪酸J.现代化工,2007,27(2:30