大豆硬脂酸-ACP脱饱和酶基因启动子的克隆及其表达活性分析_图文

1、作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(7: 12051211ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9/zwxb/E-mail: xbzwDOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01205大豆硬脂酸-ACP 脱饱和酶基因启动子的克隆及其表达活性分析张庆林1 赵 艳2,* 李晓薇1 翟 莹1 张 艳1 王 英1 李景文1,* 王庆钰1,*12吉林大学植物科学学院, 吉林长春 130062; 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院, 黑龙江齐齐哈尔 161006摘 要: 以吉豆2号基因组为模板

2、, 通过TAIL PCR方法, 扩增得到大豆硬脂酸-ACP 脱饱和酶基因启动子片段SACPD-Cp 。PLACE 在线启动子预测分析表明, 该序列中含有多种典型的种子特异性表达序列元件。将SACPD-Cp 片段取代pCAMBIA1301质粒中的CaMV35S 启动子, 构建表达载体pCAM-SACPD-Cp, 通过农杆菌介导法在大豆组织中进行瞬时表达, GUS组织化学染色和荧光定量研究其表达特性。结果表明, SACPD-Cp驱动GUS 基因在种子中的表达活性是CaMV35S 启动子的93.01%; SACPD-Cp启动子与现已知启动子无同源性, 仅在大豆种子中检测到GUS 活性, 而在根、茎和

3、叶组织中均未检测到GUS 活性, 证实 SACPD-Cp是一个新的种子特异性启动子。 关键词: 大豆; 硬脂酸-ACP 脱饱和酶基因; 序列分析; 种子特异性启动子; 瞬时表达Cloning and Activity Analysis of Soybean SACPD-C PromoterZHANG Qing-Lin1, ZHAO Yan2,*, LI Xiao-Wei1, ZHAI Ying1, ZHANG Yan1, WANG Ying1, LI Jing-Wen1,*, and WANG Qing-Yu1,*1College of Plant Science, Jilin Univers

4、ity, Changchun 130062, China; 2 College of Life Science and Agro-Forestry, Qiqihaer University, Qiqihaer161006, ChinaAbstract: The SACPD-Cp promoter of soybean SACPD-C was isolated from the genomic DNA of soybean cultivar Jidou 2 using TAIL PCR. Promoter sequence analysis by PLACE showed that the cl

5、oned fragment contained many motifs that constituted the seed-specific cis -elements. Replacing CaMV35S promoter of pCAMBIA1301 with the SACPD-Cp fragment, the binary expres-sion vector pCAM-SACPD-Cp was constructed. Transient expression by Agrobacterium tumefaciens mediated method, the his-tochemic

6、al GUS analysis and fluorometric GUS analysis were used for testing the expression of the GUS activity. The results indicated that GUS activity driven by SACPD-Cp fragment was 93.01% of that driven by CaMV35S promoter. The SACPD-Cp promoter did not have the homology compared with the reported promot

7、ers. GUS activity assays indicated that GUS was ex-pressed only in seeds, but not in roots, stems and leaves, which suggests the SACPD-Cp is a seed-specific promoter. Keywords: Soybean; SACPD-C gene; Sequence analysis; Seed-specific promoter; Transient expression粮食作物和油料作物的种子是食用的主要部分, 与人们的日常生活密切相关, 因

8、此种子中的营养成分是植物基因工程改良的重要目标。种子特异表达启动子能够驱动基因在种子中专一性表达, 使目的基因的表达产物在种子中积累, 增加表达量, 避免植物营养不必要的浪费, 使所表达的外源蛋白都集中在种子中, 最大限度地减少对农作物其他代谢途径的影响, 因此, 种子特异性启动子的研究和应用在定向改良农作物品质性状方面具有重要的理论和实际意义。随着基因工程的不断发展, 对组织特异表达启动子的需求越显迫切。近年来, 有很多种子特异启动子被分离和鉴定, 如水稻球蛋白启动子1、小麦淀粉粒结合淀粉合成酶启动子2、玉米球蛋白启动子3、花生油质蛋白、大豆油酸去饱和酶基因启动子4等, 这些启动子能促使基因

9、在特定的组织中特异表达,本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08004-003, 国家自然科学基金项目(30971808, 吉林省科技发展计划重点项目(20080204, 长春市科技局国际科技合作项目(08GH10和“211”三期建设项目资助。 *通讯作者(Corresponding authors: 王庆钰, E-mail: wqy414cn; 李景文, E-mail: lljjww998第一作者联系方式: E-mail: hn_zhangqinglin(张庆林, zhaoyan3053877(赵艳 *共同第一作者 Received(收稿日期: 2011-01-04; Ac

10、cepted(接受日期: 2011-03-27.1206作 物 学 报 第37卷避免物质、能量的浪费和影响植物的正常生长, 这些启动子已广泛用于转基因工程的研究及其应用。但与其他植物相比, 分离的大豆种子特异性启动子相对较少, 因此, 获得一种新的大豆种子特异性启动子, 对大豆新品种的研究开发及植物基因工程发展具有推动作用。硬脂酰-ACP 脱饱和酶是一种可溶性酶, 存在于质体基质中, 催化硬脂酰-ACP 脱饱和而在脂肪酸链的C9与C10间引入一个双键形成油酰-ACP 的反应。饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例与生物膜系统的流动性、选择透性以及植物的多种生理功能有密切的关系, 因此受到广泛重视, 其

11、启动子还未被克隆和研究过。本试验利用TAIL-PCR 方法扩增出硬脂酰-ACP 脱饱和酶基因上游2 081 bp的序列, 获得了硬脂酰-ACP 脱饱和酶基因启动子序列, 获得的片段构建在含有GUS 报告基因的表达载体pCAM- BIA1301中, 用其转化农杆菌EHA105, 并利用农杆菌介导法侵染大豆种子进行瞬时表达, 初步研究了SACPD-C 基因启动子的特异启动功效, 为其进一步研究提供依据。1 材料与方法1.1 试验材料大豆品种吉豆2号与大肠杆菌(E. coli DH5、根瘤农杆菌EHA105和pCAMBIA1301质粒均由吉林大学植物科学学院植物种质资源与利用研究室保存; Eco R

12、 I 、Nco I 、pMD18-T 克隆载体、Ex Taq 和T4连接酶均购自TaKaRa 公司; DNA凝胶回收试剂盒和清洁回收试剂盒购自维特洁公司, 由北京六合华大基因科技股份有限公司完成PCR 引物合成和DNA 序列测定; 5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸(X-Gluc购自上海生工生物工程公司, 4-MU和4-MUG 购自Sigma 公司, 其他试剂均为进口或国产分析纯。 1.2 SACPD-C基因启动子的克隆和序列分析采用CTAB 法提取吉豆2号幼苗叶片总DNA 作为PCR 的模板。根据SACPD-C 基因ATG 上游已知近端序列(AK245255利用TAIL-PCR 方法扩增出远端

13、序列并测序, 按照测序结果设计合成2条引物SACP-F: 5GTCC-3 (下画线表示Eco R I 酶切位点, SACP-R: 5G-3 (下画线表示Nco I 酶切位点, 将PCR 扩增产物连接到pMD18-T 克隆载体上, 对得到的重组质粒筛选并测序, 命名为pMD18-T-SACP-CP 。利用DNAMAN 软件对测序结果比对, 利用植物顺式元件数据库PLACE (plant cis -acting regulatory DNA elements, http:/ www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/5和数据库plantCARE (plant cis -ac

14、ting regulatory element, http:/ oberon.rug.ac.be:8080/PlantCARE/index.html6分析其可能的顺式作用元件。1.3 表达载体的构建测序正确的pMD18-T-SACP-Cp 质粒经Eco R I 和Nco I 双酶切后插入到pCAMBIA1301相应位点上, 以PCR 和双酶切鉴定阳性克隆, 得到SACP-Cp 和GUS 基因融合的表达载体pCAM-SACP-Cp 。阳性对照为由CaMV35S 启动GUS 基因的质粒pCAMBIA- 1301。利用冻融法将表达载体pCAMBIA1301和pCAM-SACP-Cp 转化根瘤农杆菌E

15、HA105中。 1.4 根瘤农杆菌介导法转化大豆各组织按照Hu 等7的方法, 以农杆菌介导法转化大豆根、茎、叶、种子。取大豆幼苗的根、茎、叶, 将种子去皮后切成两瓣, 分别浸于含有pCAM-SACP- Cp 和pCAMBIA1301质粒的农杆菌EHA105, 菌液重悬后OD 600约为0.2, 真空压力0.090.10 MPa, 20 min 8。1.5 GUS测定参照Jefferson 等9方法测定大豆根、茎、叶和种子中的GUS 报告基因的表达, 将侵染和未侵染的大豆各个组织取出部分, 进行GUS 组织化学染色, 加入GUS 染色液(50 mmol L1磷酸钠缓冲液pH 7.0, 10 mm

16、ol L1 EDTA, 1 mmol L1 X-Gluc, 0.1% Triton X-100, 10 mmol L1巯基乙醇 于37温育过夜, 75%乙醇脱色, 直至底色完全消失。将剩余种子在研钵中加液氮研磨成粉末, 加入提取缓冲液, 4离心, 上清液为GUS 蛋白粗提液, 用分光光度计测量蛋白浓度。取出部分加GUS 反应底物4-MUG, 于37反应10 min, 进行荧光测定, 3次生物学重复, 用获得的荧光值除以蛋白浓度和时间得到GUS 相对活性, 计算GUS 活性值。1.6 分子检测利用DNA 提取试剂盒提取大豆根、茎、叶和种子基因组DNA 。根据质粒中潮霉素序列设计引物H1: 5-T

17、TCTACACAGCCATCGGTCCA-3和H2: 5-TGAAAAAGCCTGAACTCACCG-3, 预期扩增片段1 000 bp左右。无侵染的根、茎、叶、种子为阴性对照, 质粒pCAMBIA1301为阳性对照。PCR第7期张庆林等: 大豆硬脂酸-ACP 脱饱和酶基因启动子的克隆及其表达活性分析 1207扩增产物在1.0%琼脂凝胶上电泳。 2 结果与分析2.1 启动子SACPD-Cp 的克隆用吉豆2号大豆基因组DNA 为模板, 利用上述方法进行PCR 扩增, 扩增出1条约2.1 kb特异片段, 电泳检测目的片段(图1, 并切胶回收, 与pMD18-T 载体连接后转化到大肠杆菌中, 提取质

18、粒进行鉴定, Eco R I 和Nco I 双酶切鉴定结果得到与预期相符的片段(图2, 测序正确后命名为pMD18-SACPD-Cp 。 图1 SACPD-Cp扩增产物Fig. 1 PCR amplification of SACPD-Cp M: 2000 bp DNA marker; 1: PCR产物。 M: 2000 bp DNA marker; 1: PCR amplification of SACPD-Cp.图2 pMD18-SACPD-Cp酶切鉴定Fig. 2 Restriction enzyme digestion identification ofpMD18-SACPD-CpM:

19、 2000 bp DNA marker; 1: Eco R I 和Nco I 双酶切片段。 M: 2000 bp DNA marker; 1: Eco R I and Nco I digestion ofpMD18-SACPD-Cp.2.2 启动子SACPD-Cp 的生物信息学分析利用在线软件Neural Network Promote Predic-tion 对大豆启动子SACPD-Cp 进行生物信息学分析, 进行基础启动子预测, 在411461 bp、1 1461 196 bp 、1 5301 580 bp、1 9882 038 bp和2 0212 071 bp 的位置发现基础启动子序列,

20、 其可能性分别是0.95、0.83、0.90、0.97和0.94, 后2个基础启动子区预测值较高。根据真核细胞基因启动子的基本特征, 推测可能的转录起始位点在2 062 bp处的A 。序列中含有CAAT 盒(可能与转录起始频率有关10 和TATA 盒(RNA聚合酶II 的结合位点11 及多个典型的种子特异性表达元件(图3, 如AACA 10(种子特异性元件12, E-box (常出现在参与三酰基甘油合成和植物种子特异表达基因启动子中13, SEF1 mo-tif (能够增强启动子的转录活性14 和多个顺式作用元件B-box 15、CCAA 16等。这些作用元件可能对SACPD-Cp 的表达起重

21、要的作用。2.3 瞬时表达载体的构建和农杆菌菌种的转化将SACPD-Cp 插入pCAMBIA1301的相应位置, 对培养出的单菌落提质粒后进行双酶切鉴定(图4, 获得了约2 100 bp的片段, 表明SACPD-Cp 启动子已正确插入pCAMBIA1301中, 替代了原来的CaMV35S 组成型启动子(图5, 证明SACPD-Cp 和GUS 基因融合的表达载体pCAM-SACP-Cpbei 构建成功。通过冻融法将质粒pCAM-SACPD-Cp 和pCAM-BIA1301转化根瘤农杆菌EHA105中, 用于下一步农杆菌介导大豆。2.4 GUS蛋白的种子特异性表达2.4.1 GUS组织化学染色 对

22、农杆菌侵染的大豆根、茎、叶、种子进行GUS 染色, 图6表明, 阴性对照的大豆根、茎、叶和种子几乎没有被染色, 说明GUS 报告基因没有被激活表达; 转化pCAMBIA- 1301载体的大豆根、茎、叶和种子都被X-Gluc 溶液染成蓝色, 说明在大豆根、茎、叶和种子中GUS 报告基因都可以被CaMV35S 组成型启动子激活表达; 转化载体pCAM-SACPD-Cp 的大豆根、茎、叶没有被染成蓝色, 与未侵染的大概相同, 而大豆种子被染成蓝色, 说明载体pCAM-SACPD-Cp 只能驱动GUS 报告基因在大豆种子中表达, 具有种子特异性。2.4.2 GUS荧光定量分析 荧光分析表明(图7, 阴

23、性对照的大豆根、茎、叶和种子荧光强度都比较低, 侵染载体pCAMBIA1301载体的大豆根、茎、叶和种子荧光强度相对值相差无几, 都比较高, 侵染载体pCAM-SACPD-Cp 的种子中的荧光强度相对值比根、茎、叶中高4.5倍左右; 侵染载体pCAM- SACPD-Cp 的种子的荧光强度相对值是侵染载体pCAMBIA1301的种子的93.01%。启动子SACPD-Cp 具有较强的种子特异性, 是一个全新的种子特异性1208作 物 学 报 第37卷 图3 SACPD-Cp序列的生物信息学分析Fig. 3 Bioinformatic analysis of DNA sequences of SAC

24、PD-Cp大豆SACPD-Cp 序列; +1位置为推测的转录起始位点; 推测的顺式调控元件序列为方框内字母并予以标注。DNA sequences SACPD-Cp from soybean. Putative transcription initiation site is indicated with +1. Putative cis -acting elements are showninside boxes.第7期 张庆林等: 大豆硬脂酸-ACP 脱饱和酶基因启动子的克隆及其表达活性分析 1209启动子。与CaMV35S 启动子相比, SACPD-Cp启动子种子中的荧光强度低了6.99%

25、, 分析可能是SACPD- Cp 启动子相对较长, 远端序列存在负相关元件, 这方面仍需做启动子缺失或作用元件缺失试验的进一步验证。图4 pCAM-SACPD-Cp酶切鉴定Fig. 4 Restriction enzyme digestion indentification ofpCAM-SACPD-CpM: 2000 bp marker; 1: Eco R I和Nco I双酶切片段。 M: 2000 bp DNA marker; 1: EcoR I and Nco I digestion ofpCAM-SACPD-Cp.2.5 PCR检测阴性对照的大豆根、茎、叶、种子没有扩增出约1 000

26、bp的条带; 转pCAMBIA1301质粒的大豆根、茎、叶、种子X-Gluc 染色呈蓝色的组织DNA 和质粒pCAMBIA1301均扩增出约1 000 bp的条带; 转pCAM-SACPD-Cp 质粒出现蓝色的种子和未出现蓝色的根、茎、叶中均扩增出约1 000 bp的片段(图8, 表明pCAMBIA1301和pCAM-SACPD-Cp 通过农杆菌侵染法转入相应组织中。 图5 植物表达载体pCAM-SACP-Cp 构建过程Fig. 5 Construction process of expression vector pCAM-SACP-Cp 图6 大豆不同组织的GUS 组织化学染色分析Fig.

27、 6 Histochemical analysis of GUS activity in differentorgans of soybeanA: 未侵染的大豆; B: GUS基因由CaMV35S 启动子驱动; C: GUS基因由SACPD-Cp 启动子驱动。A: non-transformed soybean; B: the GUS gene driven by CaMV35S;C: the GUS gene driven by SACPD-Cp. 图7 CaMV35S和SACPD-Cp 融合GUS 基因表达载体在大豆组织中的GUS 活性分析Fig. 7 GUS activity analy

28、sis in different organs of soybean trans-formed by the vectors with CaMV35S and SACPD-Cp fused toGUS reporter geneCK: 负对照; CaMV35S: 正对照; SACPD-Cp: 侵染pCAM-SACPD-Cp 表达载体的大豆组织。CK: negative control; CaMV35S: positive control; SACPD-Cp: soy-bean tissues transformed with expression vector pCAM-SACPD-Cp.12

29、10 作 物 学 报 第 37 卷 表达量应该比较高, 本试验比较了 CaMV35S 启动 子和 SACPD-Cp 启动子在大豆种子中驱动 GUS 基 因表达的能力, SACPD-Cp 驱动 GUS 基因在种子中 的表达活性是 CaMV35S 启动子的 93.01%, 推测大 豆 SACPD-Cp 启动子远端序列可能存在负相关元件, 还有待进一步研究。 本试验表明 SACPD-Cp 启动子具有较强驱动下 游基因在种子特异性表达的特点; 但 SACPD-Cp 启 动子作用元件具体如何调控该启动子, 仍需进一步 图 8 大豆各个组织的 PCR 检测 Fig. 8 PCR detection res

30、ult of soybean organs M: 2000 bp marker; 1: 质粒 pCAMBIA1301; 25: 分别为阴性对 照的根、茎、叶、种子; 69: 分别为转 pCAMBIA1301 的根、茎、 叶、种子; 1013: 分别为转 pCAM-SACPD-Cp 的根、茎、叶、 种子。 M: 2000 bp marker; 1: pCAMBIA1301; 25: root, stem, leaf, seed of negative control; 69: Root, stem, leaf, seed transformed with expression vector pC

31、AMBIA1301; 1013: root, stem, leaf, seed transformed with expression vector pCAM-SACPD-Cp. 深入研究。 4 结论 克隆得到一个全新的大豆种子特异性启动子 SACPD-Cp。该启动子在大豆种子中的启动活性是 CaMV35S 启动子的 93.01%, 推测 SACPD-Cp 启动 子远端序列存在负相关元件。 3 讨论 本研究通过 TAIL PCR 和 PCR 方法首次分离大 References 1 Hwang Y S, Yang D, McCullar C, Wu L, Chen L, Pham P, Nan

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37、E-box 和 ACGT 序列各 5 个拷贝; RY-repeat 序列元 件 2 个拷贝等。 分析结果表明, SACPD-Cp 启动子中 存在种子特异性表达的调控元件, 能调控 GUS 基因 在种子中特异性表达。另外, 该启动子序列中还含 有多个转录因子顺式作用元件和多个逆境相关元件, 如 ACGT、 MYBST1、 MYBCARE 等, 因此对 SACPDCp 启动子顺式作用元件的深入研究对了解该启动 子的具体作用有实际意义。 在植物的代谢过程中, 基因的表达调控是一个 非常复杂的过程, 启动子的启动能力有可能影响到 基因的表达情况, 一个组织特异性强、表达模式与 强度适宜的启动子, 往往

38、是基因工程试验成败的关 键 19 。完整的或较长的启动子中含有种子特异性序 列元件拷贝数的多少与启动子活性的强弱相关 20。 膜脂不饱和脂肪酸必须维持在较高水平, 植物才能 生存, 硬脂酸-ACP 脱饱和酶是最重要的脱饱和酶 21 , 第7期 张庆林等: 大豆硬脂酸-ACP 脱饱和酶基因启动子的克隆及其表达活性分析 1211 Q-L(张庆林, Yan F(闫帆, Wang Q-Y(王庆钰, Zhang Y(张艳, Li J-W(李景文. Cloning and transient expression of soybean Lox3 promoter. Biotechnol Bull (生物技

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