Restin基因启动子的克隆及其在HeLa细胞中的转录活性

1、    Restin基因启动子的克隆及其在HeLa细胞中的转录活性            作者：时间：2007-11-22 11:36:00                          

2、;                                                  

3、; 作者：王瑞华，傅海燕，杨国栋，路凡，赵忠良 【关键词】  全反式维甲酸    Molecular cloning of restin gene promoter and its transcriptional activities in HeLa cells【Abstract】 AIM: To clone the promoter and construct its luciferase report vector of our newly found gene restin and to analyze its response to the st

4、imulation with alltransretinoic acid (ATRA). METHODS:  Approximate 2000 bp up from the ATG of gene restin was bioinformatics analyzed with computer. The fragment was generated by polymerase chain reaction and cloned the upstream of luciferase report gene into plasmid pG5luc, replacing the five

5、GAL4 binding sites and adenovirus promoter to generate the plasmid Rpluc. Rpluc was transfected into HeLa cells and luciferase activities were measured with or without the treatment of ATRA at indicated time. RESULTS:  We successfully cloned and identified the promoter of the gene restin and co

6、nstructed its luciferase report plasmid. Obvious response to ATRA was found when transfected into HeLa cells and a high expression of luciferase was detected when induced with ATRA. CONCLUSION:  The luciferase report system of restin gene promoter we have constructed can be applied for further

7、study of the function and transcriptional regulation of restin.【Keywords】 restin；transcription regulation；promoter；alltransretinoic acid【摘要】 目的：扩增细胞静息因子(restin)基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统，探讨其对全反式维甲酸(alltrans retinoic acid, ATRA)刺激的反应. 方法：对restin基因上游约2000 bp基因组序列进行计算机生物信息学分析. 利用PCR技术扩增restin基因上游序列，将其克隆入pG5lu

8、c中，插入荧光素酶报告基因上游，取代5个GAL4结合位点及腺病毒启动子，构建Rpluc质粒. 将构建的质粒转染入HeLa细胞，ATRA诱导检测该质粒中荧光素酶的表达. 结果：酶切及测序结果均证实成功克隆了restin基因上游序列，已将该序列插入到荧光素酶基因的上游；ATRA诱导转入HeLa细胞中的真核表达载体Rpluc，荧光素酶表达明显增加. 结论：成功构建了含有restin基因启动子序列的荧光报告系统，为进一步研究restin基因功能及其转录调控奠定了基础.【关键词】 restin；转录调控；启动子；全反式维甲酸0引言细胞静息因子(restin)基因是在全反式维甲酸（alltrans ret

9、inoic acid, ATRA）诱导的肿瘤细胞中差异表达的基因之一（Genbank登录号:  NM_014061），属于黑色素瘤相关抗原（melanoma associated antigen，MAGE）家族，将其导入白血病细胞可以抑制细胞增殖1-2. 路凡等3认为可以将MAGE家族分为酸性MAGE蛋白和碱性MAGE蛋白. 有意义的是碱性MAGE蛋白在终末分化细胞和生殖细胞中表达，而在肿瘤细胞中不表达或低表达，而酸性MAGE蛋白则在终末分化细胞中不表达，只表达在肿瘤细胞和生殖细胞中. 同时在ATRA诱导的肿瘤分化细胞中，表现出酸性MAGE蛋白降低和碱性MAGE蛋白升高，restin

10、正好也为碱性MAGE蛋白. 组织表达谱分析表明restin主要表达在正常终末分化组织，而在肿瘤组织中不表达或表达量极低4. 因此，研究restin的表达调控不但可以增强对restin的作用机制的理解，同时也可促进对肿瘤细胞分化控制机制的了解. 我们根据生物信息学分析结果的提示，从胎儿肌肉基因组DNA中扩增得到含预测启动子区和调控元件restin基因翻译起始位点上游约2000 bp DNA序列，并利用KpnI 酶切位点和NcoI酶切位点将扩增序列导入荧光报告载体pGL5Luc中，取代5个GAL4结合位点及腺病毒启动子，然后将构建好的质粒转入HeLa细胞中检测ATRA诱导前后转录活性，为研究该基因的转录调控及功能奠定基础.1材料和方法1.1材料1.2方法2结果2.1转录因子结合位点和启动子预测结合文献报道的与凋亡和ATRA相关的转录因子的结合位点，对restin基因