一个具有肿瘤转移抑制基因活性的人DNA序列

1、一个具有肿瘤转移抑制基因活性的人DNA序列【摘要】目的分离鉴定人类肿瘤转移抑制基因或相应DNA序列, 探讨转移表型逆转的分子生物学机制。方法应用Inter Alu PCR技术，将导入正常人肺基因组DNA片段后转移表型抑制细胞株中的人源性DNA片段扩增出来,对其中的700 bp左右DNA片段进行核苷酸序列分析，并在GenBank序列数据库进行类似性检索。将该DNA再次转染高转移小鼠瘤细胞株，通过体内、体外转移相关性实验，验证其是否具有抑制高转移小鼠肺癌细胞转移的能力。结果同源性比较显示，上述700 bp人DNA片段为未知人基因组DNA序列,已被GenBank收入数据库（pt712 U67835）

2、。将该DNA再次导入高转移小鼠瘤细胞后，体内、体外转移相关性实验均表明，该转染细胞对高转移小鼠肺腺癌细胞转移表型具有一定的抑制作用。结论从转移表型逆转小鼠细胞中分离出的700bp人基因组DNA序列,具有使肿瘤细胞转移表型发生逆转的重要作用。【主题词】肿瘤转移抑制基因序列分析人基因组DNA基因转染聚合酶链反应 A novel human DNA sequence with tumor metastasis suppressive activityGE Xueming, LU Yinglin, FU Shengfa, et al.Institute of Basic Mediccal Scienc

3、es, Beijing 100850【Abstract】ObjectiveTo isolate human tumor metastasis suppressive DNA sequence and to study the molecular mechanisms regulating tumor metastasis. MethodsA mouse lung adenocarcinoma cell clone 12 derived from its parent cell line LM2, which had been transduced with normal human genom

4、ic DNA, was previously reported. Compared with LM2, the metastatic potential of clone 12 was very much decreased. Clone 12 was used in this study to amplify the human DNA fragments by Inter Alu PCR technique. The human DNA fragments obtained were then transfected into LM2 cells and their malignant p

5、henotype was observed in vitro and in vivo, and compared with that of the untransfected LM2 cells. ResultsThree human DNA fragments of 700, 500 and 300 bp were isolated. DNA sequencing revealed that the 700 bp fragment does not show homology with hitherto reported genes and was accepted by the GenBa

6、nk (pt 712 U67835). In vitro proliferation and colony formation in soft agar of the 700 bp fragment-transfected LM2 cells were significantly inhibited as compared to the untransfected LM2 cells. Upon subcutaneous inoculation to syngeneic T739 mice, the 700 bp-transfected LM2 cells grew more slowly a

7、nd smaller tumors developed compared to the un-transfected ones. Moreover, lung metastasis was not found in 6 of 10 mice inoculated with the 700 bp-transfected LM2 cells, while it was found in 9 of 10 mice inoculated with the un-transfected LM2 cells. The difference was statistically significant (P2

8、 cm或荷瘤小鼠十分孱弱时处死、解剖，常规取材，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下阅片。结果1.12号转移表型回复突变株中人源性DNA片段（h700DNA）的克隆分析：提取12号转移表型回复突变细胞株的基因组DNA作为模板, 采用Inter Alu PCR技术5对其进行PCR扩增，获得了700,500,300 bp的3条人源性DNA片段。我们将其中的700 bp人源性DNA片段（h700DNA）重组构建后进行核苷酸序列分析, 并与GenBank序列数据库进行序列类似性检索, 未发现与之同源的基因序列, 现已被GenBank作为人类新基因组DNA片段录入, 登录号为pt712 U67835。人源性D

9、NA片段部分序列结果如下:ATCTGCACTCCAGCCTGGGGTATATGAGATCAAGCTGGGACTTAGTCTTCGCATAACTGGATGCTCATGACTATACATTATGTATAGGACGTGATATGGATATGGCCTTAATATTAATGATTTTCCCCCTAGAGAAGAGAAATAAAATTTTTGAAAGTTTAAGTGATAGAGCAATATTTGTAGTCATGAATTCTTACTTCTTTCCTTCTGCTTGTCTTGTGGTTGGATATTGCATGGGTGGTCCTGATGTTGGCTTCTAATTTGAGTTTATGCTTAAGAGTTCCAGA

10、AGATCAATGTCTGGAAAATTGGTATCTACCTATCTGTTTGTCTACTGGTGAAAGCAAAGGGTATTTTAGCTGTATCTGTCTCACTGCTCGTTTTTCCTGTATAGTGTGGTGGTGTGTGTGTGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAACCATTAATGCAGTAATCCNCCAATTGGACCTCATGCCCAGGCTGGGAAGTGCAGAATCCACNAAGGTGCGGGCCGCCTGCAN2.h700 DNA 片段基因转导高转移小鼠LM2细胞中h700 DNA 片段的表达：h700DNA片段经基因转染导入高转移小鼠肺腺癌LM2后获得一

11、转染细胞(LM2-h700)，将该人源性DNA片段经(长臂)光敏生物素标记后，以此为探针(2 g)分别与转染h700的转染细胞及对照LM2细胞总RNA(各约10 g)进行狭缝杂交。结果显示，转染h700DNA的细胞总RNA杂交出现蓝紫色杂交带, 说明该转染细胞中存在人源DNA片段mRNA水平转录表达。3.h700 DNA 片段基因转导小鼠LM2细胞后细胞形态的变化：未转染LM2细胞体外培养呈短梭形或圆形，立体感及折光性强; 而h700DNA转染细胞体外培养的大多数细胞为扁平镶嵌状，折光性及立体感均减弱，与未转染LM2细胞形态有明显不同。4.h700 DNA 片段基因转导对小鼠LM2细胞体外增殖

12、的影响：采用直接计数法检测h700DNA转染组及未转染LM2对照组细胞的体外增殖速度，h700DNA转染细胞较未转染对照细胞体外增殖速度明显减慢(P0.001，1)。1h700 DNA转染细胞及对照LM2细胞生长曲线5h700 DNA 片段基因转导对小鼠LM2细胞软琼脂中集落形成的影响：未转染组LM2细胞一般5天内即形成明显簇状细胞集落，且细胞集落较大，形成数目较多；而h700DNA转染组细胞生长速度较为缓慢，集落小且形成数目明显减少（表1）。表1细胞软琼脂培养集落形成数比较细胞接种细胞数集落数(个/皿)s1234对照细胞5103106911011101028.2(LM2)转染细胞510338

13、25302930.55.5(LM2-h700)注：两组间相互比较，P0.001 6.h700 DNA片段基因转导对LM2细胞同系T739小鼠体内成瘤及转移特性的影响：对各组肿瘤细胞在T739小鼠体内的成瘤时间、肿瘤结节大小、转移率以及转移部位分别进行了统计。从2可以看到，人源DNA片段转染组细胞接种同系T739小鼠皮下后, 小鼠平均成瘤时间较未转染对照组明显延长, 生成肿瘤体积亦较小(P0.001)；而接种未转染对照LM2细胞的小鼠明显消瘦，且生成的肿瘤结节大。小鼠解剖后，肺、淋巴结转移情况明显不同：皮下接种转染细胞的10只小鼠中，有6只无肺转移；而接种对照LM2的10只小鼠中，9只肺上有转移

14、, 两组肺转移情况存在明显差异(P0.001)。接种转染细胞的10只小鼠中，有2只存在淋巴结转移；而接种对照LM2小鼠中，发生淋巴结转移的有4只, 两组之间比较，差异有非常显著性(P0.001，表2)。2h700 DNA转染及对照LM2细胞T739小鼠皮下接种后的平均成瘤曲线 表2接种不同肿瘤细胞的T739小鼠肺、淋巴结转移情况比较组别肺转移灶/五叶肺淋巴结转移/淋巴结数转移率(%)对照LM2组31/507/35100(10/10)转染细胞组11/502/3850(5/10)注：()内为肺、淋巴结有转移的小鼠数/荷瘤小鼠数 讨论表型克隆1是目前克隆未知基因的一个新概念，即在无需了解基因染色体定

15、位及精确功能的前提下，对因突变而导致某一特殊表型的基因进行克隆分析的方法。克隆癌基因或转移相关基因的DNA转染方法，就属于表型克隆的研究思路，即将未知DNA导入正常细胞使之发生转化，产生恶性表型，再从转染细胞中克隆筛选起作用的DNA整合序列。我们采用上述方法的逆向思维，将癌细胞作为转染靶细胞，导入正常基因组DNA后筛选回复突变的转染细胞，再进一步克隆可能的抗性基因，这种方法具有定向选择性。我们将高转移小鼠肿瘤细胞作为靶细胞，导入人正常基因组DNA后，对发生转移表型逆转的小鼠瘤细胞进行筛选，获得了转移表型回复突变的小鼠转染细胞4。又应用Inter Alu PCR技术，从12号转移表型逆转小鼠转染

16、细胞中，分离出插入的人源性DNA序列。对其中的700 bp DNA片段进行了序列分析及同源性比较，并已在Genbank登录（pt712 U67835）。我们使用PCGENE软件，对该序列进行了结构的初步分析, 发现其可能存在的开放阅读框架(ORF)包含228 bp，可编码76个氨基酸，但受所获片段长度的限制，对其结构还有待进一步分析预测。值得注意的是，将该人源性DNA片段再次导入高转移小鼠肺腺癌细胞后，通过一系列体内外转移表型相关性实验表明，其可引起该肿瘤细胞生长及转移能力的抑制。分析导致上述结果的机制可能有以下几种：(1)导入的正常人源性DNA片段在转染细胞基因组整合后, 其表达产物具有抑制

17、该细胞转移表型的直接作用。(2)导入的人源DNA片段有可能是一个转移表型调控序列或调控单元, 能调节转染细胞内其他转移基因的表达。(3)由于人源性DNA片段导入，其插入位点影响了转染细胞内某些基因的功能，从而使其恶性程度得到抑制。鉴于肿瘤转移是肿瘤细胞多基因和多环节的特性的总和, 并受到宿主体内环境影响，h700DNA基因转导高转移小鼠肺癌细胞对其体内外生长特性影响的确切机能及其意义, 尚需进行更深入地探讨，包括: (1) 以该DNA片段作为基因探针, 经基因文库筛选获得其完整基因, 从而可对该基因结构功能进行分析预测。 (2)将所获得的完整目的基因转导人类高转移肿瘤细胞, 观察转染后细胞体外

18、以及在裸小鼠体内的转移情况, 进一步鉴定此基因与转移的相关程度。 (3)将目的基因通过基因转染，验证其在不同类型瘤细胞中是否具有普遍性的抑制作用。 (4)用目的基因的反义RNA封闭人类低转移性肿瘤细胞, 观察在裸小鼠体内的转移情况。本课题受国家自然科学基金资助(编号39370761)作者单位：100850 北京，军事医学科学院基础医学研究所参考文献1Jonsson JJ, Weissman SM. From mutation mapping to phenotype cloning. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:83-85.2Diatchenko L,Lan

19、YF,Campbell AP,et al.Suppression subtractive hybridization:a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probe and libraries.Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:6025-6030.3Noda M,Selinger Z,Scolnick EM, et al. Detection of genes with a potential for suppression of transformed phenotyp