说明成果讲稿生化上

1、第五章第五章核核酸酸生物化学 第四节 核酸的性质（一）酸水解（一）酸水解对酸的敏感性：糖苷键磷酸酯键 嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键利用酸水解可以研究核酸的碱基组成。（二）碱水解（二）碱水解RNA的磷酸酯键对碱敏感。DNA抗碱水解。 生理意义：DNA更稳定 ，遗传信息。RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。一、核酸的水解一、核酸的水解（三）酶水解（三）酶水解u非特异的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3-核苷酸u特异的磷酸二酯酶： 核酸酶第四节 核酸的性质一、核酸的水解一、核酸的水解1、核酸酶的分类、核酸酶的分类n 底物专一性：底物专一性：

2、核糖核酸酶 RNase脱氧核糖核酸酶 DNasen 作用方式：作用方式：核酸外切酶（exonuclease)、核酸内切酶 (endonuclease)。单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶n 磷酸二酯键的断裂方式：磷酸二酯键的断裂方式：5-（寡）核苷酸3-（寡）核苷酸 核酸酶l RNase H作用于DNA-RNA中的RNA链l 牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease) , RNase I最适pH ：7.0-8.2产物：以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，高度专一的内切酶l RNase T1耐热、耐酸产物：以3-鸟苷酸结尾的寡核苷酸，专一性更高l RNase T2产物：以3-腺

3、苷酸结尾的寡核苷酸核酸酶2、RNasel 核酸酶核酸酶S1作用于单链DNA部分l 牛胰核糖核酸酶，牛胰核糖核酸酶，DNase I切断双链或单链DNA产物：以5-磷酸为末端的寡核苷酸l DNA限制性内切酶限制性内切酶 具有非常严格的碱基序列专一性具有非常严格的碱基序列专一性核酸酶3、DNase4、N-糖苷酶糖苷酶以限制性内切酶及连接酶进行核酸剪接GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGAATTCGGCTTAAGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGEcoRIDNA LigaseEcoRI sticky endEcoRI sticky

4、 endJuang RH (2004) BCbasics目标基因殖入质粒并转化宿主菌1 plasmid1 cell重组质粒转化宿主目标基因殖入质粒限制酶限制酶染色体目标基因重组 基因细胞转化宿主菌Juang RH (2004) BCbasics二、二、 核酸的酸碱性质核酸的酸碱性质 核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约为45，RNA的pI约为2.02.5，在pH78电泳时泳向正极。第四节 核酸的性质1、碱基的解离、碱基的解离2、核苷的解离、核苷的解离 3、核苷酸的解离、核苷酸的解离4、核酸的滴定曲线

5、、核酸的滴定曲线三、三、 核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收 碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有强烈的光吸收，max=260nm第四节 核酸的性质1、鉴定纯度、鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85）纯RNA的A260/A280应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。2、含量计算、含量计算1 ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL寡核苷酸3、判断、判断DNA是否变性是否变性在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应）在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数

6、减小（减色效应）第四节 核酸的性质四、四、 核酸的变性、复性及杂交核酸的变性、复性及杂交第四节 核酸的性质(一一)变性变性核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。当核酸的氢键在外界因素的影响下当核酸的氢键在外界因素的影响下,发生断裂发生断裂,使两条链分使两条链分开开,但不降解但不降解.叫核酸的变性叫核酸的变性. 第四节 核酸的性质1、影响核酸变性的因素、影响核酸变性的因素:1).外因外因:凡能破坏氢键和碱基堆积力的因素,都是核酸变性的因素.如: A热变性, B酸碱变性（pH小于4或大于11）, C有机试剂变性（尿素、盐酸胍、甲醛）

7、等.2).内因内因:A.碱基的含量.(AT易变性,GC不易) B.DNA的均一性. C.碱基的顺序效应.1).DNA的变性现象 将DNA的稀盐溶液加热到80-1000C,几分钟后,DNA将发生一系列的物理化学性质的改变(宏观表现).u 260nm的紫外吸收值升高.(增色效应)u 比旋下降.u 粘度下降.u 浮力密度升高.u 酸碱滴定曲线改变.u 生物活性丧失. 第四节 核酸的性质2、DNA的热变性与的热变性与Tm值值增色效应与减色效应增色效应与减色效应增色效应：DNA变性过程中，摩尔吸光系数增大。减色效应：DNA复性过程中，摩尔吸光系数减小。第四节 核酸的性质核酸的变性与复性Garrett &

8、amp; Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.373增色效应增色效应减色效应减色效应DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。Hyperchromic Effect 核酸变性观察50 70 901.31.21.11.0Temperature (C)Relative absorbance (260 nm)TmAdapted from Voet et al (1999) Fundamental of Biochemistry p.739DNA变性作用发生在一个很窄的温度范围内。2、 熔解温度（熔解温度（Tm）：）：uDNA的双螺旋结构失去一半时对

9、应的温度。u浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性（单链）A260= 1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。uDNA的Tm一般在8295之间溶解温度 Tm3、 影响影响DNA的的Tm值的因素值的因素DNA均一性 。 均一性高，变性温度范围越窄，据此可分析DNA均一性 。溶解温度 Tm核酸 G+C 组成分越高者 Tm 越大70 80 90 1001.41.21.0Relative absorbance (260 nm)Temperature (C)Pneumococcus肺炎球菌肺炎球菌(38%) G+CE. coli (52%)S

10、. Marcescens粘质沙雷氏菌粘质沙雷氏菌 (58%)M. Phlei分枝杆菌分枝杆菌 (66%)Adapted from Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.372G-C含量与Tm值成正比。测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44核酸 G+C 含量与Tm值成正比介质中离子强度介质中离子强度离子强度高，Tm高。Tm值与介质中离子强度的关系阳离子中和核酸的负电荷而使 Tm 增大60 70 80 90 100 110100806040200Tm (C)G + C (%)0.15 M NaCl0.015 M

11、Na citrate 0.01 M phosphate0.001 M EDTA3553DNA分子的复性(二二)、复性、复性 指经加热变性的DNA在适当条件适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为退火退火(annealing)。DNA分子的复性u 复性机制：10-20bp成拉链u 热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。u 复性速度可用Cot衡量。u Co为变性DNA原始浓度molL-1，t为时间，以秒表示。变性DNA在适当条件下（一般低于Tm 值2025） ，两条链重新

12、缔合成双螺旋结构重新缔合成双螺旋结构。核酸复性的速度与其基因组复杂度有关 p51010-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 1 10 100 1K 10K00.51.0Fraction reassociatedc0t (mole/L sec)1 10 102 103 104 105 106 107 108 109 1010E. coliT4MS2Mousesatellite牛CalfPoly U/Poly A复性所需时间 (长)基因组大小分子杂交（三）分子杂交：（三）分子杂交：(hybridization)(hybridization) 不同来源不同来源的核酸变性后，合并在一

13、处进行复复性性，这时，只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段形成碱基互补配对的片段，复性也会发生于不同来源不同来源的核酸链之间，即形成所谓的杂杂化双链化双链，这个过程称为杂交杂交(hybridization)。1、SouthernBlottinguDNA样品 酶切 电泳 碱变性 转膜 固定 杂交 洗涤 放射自显影uSouthern Blotting可用于DNA之间同源性之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小序列的大小和定位和定位。(三三) 分子杂交分子杂交分子杂交核酸分子间的杂交反应 hybridizationRNADNA1DNA2探針Southernhybridiza

14、tionNorthernhybridizationJuang RH (2004) BCbasics杂交可以杂交可以发生于发生于DNADNA与与DNADNA之间，之间，也可以发也可以发生于生于RNARNA与与RNARNA之间和之间和DNADNA与与RNARNA之间。之间。Southern blotting（印迹法）Southern Blotting 的转印Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.499 取出转印纸以探针杂交呈色 Alberts et al (2002) Molecular Biology of the C

15、ell (4e) p.4992、NorthernBlotting研究对象是mRNA，探针一般是DNA。总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）3、WesternBlotting抗原与抗体的杂交研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。Northern blotting（印迹法）菌落转印到滤纸后以探针杂合盖上滤纸显像呈色加入探加入探針針转印中取出滤紙溶解细胞 核酸变性Colony hybridization样本 DNA每一点上涂布有 已知 DNA生物芯片互补的 DNA 会互相杂合产生信号基因芯片利用杂交反应第五节第五节 核酸研究技术核酸研究技术一、一、核酸的分离纯化和定量核酸的分离

16、纯化和定量n 尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。n 条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。n 抑制核酸酶。（一）（一）DNA分离纯化分离纯化u 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。u DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。u 水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀。一、核酸的分离纯化和定量一、核酸的分离纯化和定量（二）（二）RNA的制备的制备RNase 的灭活：p 玻璃器皿：1

17、40-200 ，8小时；p 塑料器皿：0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)，37 ，过夜p 提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍p 反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂一、核酸的分离纯化和定量一、核酸的分离纯化和定量l 不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来。l 这一方法常用于质粒DNA的纯化。二、核酸的沉降特性与超速离心二、核酸的沉降特性与超速离心超螺旋超螺旋DNADNA或或（一）琼脂糖电泳（一）琼脂糖电泳用于用于大片段大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广的分离，精度低，但分离范围广影响迁移率的因素：

18、核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比 凝胶浓度 DNA的构象，超螺旋最快，环型其次，线型最慢超螺旋最快，环型其次，线型最慢。 电压，不大于5V/cm染色：0.5ug/ml EBRNA的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛(denaturizing the RNA, making the bands sharp)三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳琼脂糖电泳可以用于琼脂糖电泳可以用于DNA分子量的测定分子量的测定三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳（二）（二）PAGE电泳电泳 以聚丙烯酰胺作支持物，这种凝胶的孔径比琼以聚丙烯酰胺作支持物，这种凝胶的孔径比琼脂糖胶要小，所以可用于分析相对分子

19、质量小脂糖胶要小，所以可用于分析相对分子质量小于于1000bp的的DNA片段和片段和RNA的电泳。聚丙烯的电泳。聚丙烯酰胺凝胶强度较好，常用垂直板电泳。酰胺凝胶强度较好，常用垂直板电泳。三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳(一一)、 限制修饰系统限制修饰系统 限制性内切酶限制性内切酶往往与一种甲基化酶甲基化酶同时成对存在，构成一个限制修饰系统限制修饰系统，甲基化酶使细菌自身的DNA带上标志，限制性内切酶专门用于降解入侵的外源DNA。p限制酶的命名，如：E.coRIp第一位：属名E（大写）p第二、三位：种名的头两个字母小写cop第四位： 菌株Rp第五位： 从该细菌中分离出来的这一类酶的编号四、限

20、制性核酸内切酶与四、限制性核酸内切酶与DNADNA物理图谱构建物理图谱构建（1979年发现年发现 ）同裂酶：同裂酶：来源不同的限制酶（名称自然不同），识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。 BamHI：GGATCC BstI： GGATCC MboI：GATC Sau3A：GATC同尾酶：同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但都产生相同的粘性末端。 BclI：TGATCA BglII：AGATCA 四、限制性核酸内切酶与四、限制性核酸内切酶与DNADNA物理图谱构建物理图谱构建(二二)、 DNA物理图谱及构建物理图谱及构建（限制酶切图谱、DNA酶切位点图谱）在研究某一种DNA时，弄清

21、该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础。四、限制性核酸内切酶与四、限制性核酸内切酶与DNADNA物理图谱构建物理图谱构建（一）双脱氧终止法（一）双脱氧终止法英国 Sangerl 1955 确定牛胰岛素结构， 1958 获诺贝尔化学奖。l 1975 设计出DNA测序法， 1980 获诺贝尔化学奖。l 合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。五、五、 DNA序列分析序列分析五、五、 DNA序列分析序列分析核酸测序原理Polyacrylamide Gel ElectrophoresisATC32PAT32PA32PT A G CTACGATCG32PAT

22、CGA32PATCGAT32PATCGATC32PATCGATCG32PATCGATCGA32PATCGATCGAT32P凝胶电泳泳可以分开各种不同长度的核酸，在电泳胶片依序排开但这样的图谱不能判别出各核酸端点的核苷酸种类若能把尾端核苷酸相同的片段提出，跑在同一行，由比较这样的四行，即可读出序列。Sangers Method:Maxam-Gilberts Method:做出不同长短核酸的方法32P32PATCGATCG32PATCGATATCGATATCGTAGCTAGCTATAGCTAGCTATAGCTAGCTAATCGASpecific Reaction to G ATCGSTOPA中止合成继续合成生物合成法化学法Templateor无放射性片段不能显像A,T,C,GAAnalogue破坏断裂破坏断裂ATCGATCGAT产生各种片段32P32P32PPhosphodiesterbondP R P R P R P R P R P ROH531 135A1 12 23456APO4 2-H352 2HdideoxynuceotideddNTP 生物合成核酸测序法的反应 可正常连结无法再接下去Juang RH (2004) BCbasicsDNA测序仪原理DNA序列分析仪：序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTP焦磷酸测序技术原理（二）（