发酵工程实验技术实验指导

1、发酵工程实验技术实验指导适用生物工程专业食品与生物工程学院2008.7实验一 红葡萄酒酒的酿造一、实验目的学习并掌握酸果酒的酿造的基本原理和方法。二、实验原理酵母分为天然酵母和人工培养酵母两种。天然酵母即野生酵母，常附着在果皮上。果汁在酵母菌作用下将中的葡萄糖发酵生成酒精并且产生二氧化碳。当前发酵结束后，对果酒进行过滤，控制温度，进行后发酵，可进一步提高酒的品质和口味。为了保证酵母菌发酵纯正，防止或抑制其它杂菌的活动，必需对果汁进行二氧化硫处理。二氧化硫可以抑制大部份杂菌的活动，但不影响正常酵母的活动，它具有对果酒汁进行杀菌，澄清，抗氧化，溶解和增酸的作用。三、材料和设备瓷盘，250ml三角瓶

2、（每组4），1ml吸管，角勺，玻棒,台秤，糖度计，吸球, 2层纱布，鲜葡萄，猕猴桃，亚硫酸（6、1500mL），果酒活性干酵母，蔗糖，试纸（PH3.5），天平，100ml烧杯，100ml量筒，水浴锅四、方法： 1、用具清洗：以1亚硫酸荡洗烧杯、玻棒、三角瓶等所有实验中可能与预料葡萄酒相接触的用具，达到杀菌的目的，待亚硫酸挥发干净后方可使用。2、选料：葡萄（选择充分成熟、色泽鲜艳、无病和无霉烂的果实为原料，去掉杂质并冲洗干净表面的泥土。）3、破碎：去除梗，清水洗涤，凉干。挤破果实，每个处理1瓶，每瓶装0.4斤葡萄，测糖度，测PH值。4、调糖；先测定果浆的含糖量，按生成10酒精需要18糖的比例进行

3、调糖，添加能产生约10酒精的蔗糖（1825），搅拌溶解。5、二氧化硫处理：二氧化硫的添加常在破碎时或果汁入罐发酵前一次加入，这样杀菌效果较好。一般常用6%的亚硫酸H2SO3来获得SO2，一般用量是每升果汁加入2.5毫升亚硫酸。6、活性干酵母活化：按1g干酵母/L果汁的用量，称取活性干酵母，在40温水中加入10的活性干酵母，静止复水活化，8min轻轻搅拌一次，活化20min后，加入处理葡萄果汁。7、主发酵：把调好的果浆装入容器内，覆盖二层纱布（防治爆瓶、防虫）。25发酵，每天搅拌发酵料，当残糖降至5%左右时主发酵结束（发酵7天）。两层纱布过滤去皮渣。 8、后酿：置于15的环境中贮存，使果酒成熟，

4、成熟期约需 4天。9、调配甜酒：调配120g/L糖甜酒，根据原酒的含糖量和要勾兑的含糖量称取相应的蔗糖，搅拌均匀。样品处理情况处理1处理2处理3处理4酵母SO2蔗糖五、作业：观察、记录发酵过程中的起酵时间和糖度、PH、颜色、气味及发酵程度的变化情况。对结果进行分析。观察时间颜色气味PH糖度发酵程度（现象）2天4天7天实验二、纳豆的发酵生产及其纳豆芽孢杆菌在发酵过程的生物学变化一、 实验目的 纳豆是日本传统的养生保健食品，是大豆经纳豆杆菌发酵而成的。纳豆能产生纳豆激酶，具有预防心梗、脑血栓、动脉硬化以及软化血管、降胆固醇、调节血糖、预防骨质疏松、口腔溃疡，保护肠胃治疗便秘、美容和抗癌效

5、果等功效。 我国大豆资源极其丰富，廉价易得，是纳豆事业推广普及并可持续发展的有力保证。通过本实验菌种制备和纳豆工艺优化等内容的学习，要求学生综合运用本课程及其前期所学课程的有关知识，完成纳豆的制作全过程，并对整个发酵过程中纳豆芽孢杆菌的生物学形态进行跟踪观察，使学生对纳豆生产的宏观形态变化和微观的生物学变化之间建立联系，从而对发酵食品产生由表及里地认识，同时将灭菌技术、无菌操作技术及显微技术等微生物三大技术融会贯通。二、 实验原理 纳豆杆菌蛋白酶活性很高，能力强，纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilis Natto) 在以大豆为底物发酵时，借助其较强的蛋白酶系, 对大豆蛋白进

6、行降解，使60%的大豆蛋白都变成可溶性蛋白质，且生产风味物质。其表观最大特点是产出粘性物质，并可拉丝，也是纳豆枯草杆菌的生理特性，这种 拉 丝 物质是谷氨酸多肽(PGA)及果聚糖混合物，拉丝性能在最为安定，碱性或酸性，其拉丝性能都会降低，易于切断。纳豆枯草杆菌的孢子耐热性较枯草杆菌的孢子高1.6倍，高温可以杀死杂菌，而纳豆枯草杆菌的孢子被高温所激活，迅速发芽、繁殖。发酵过程中氨量会增加，能闻到有氨味，但氨味过强，一般表明杂菌污染。三、 实验材料试管及配套硅胶塞，牛肉膏，蛋白胨，琼脂条，无菌水，120cm平皿，2mL吸管，纱布，纳豆杆菌菌种，培养箱，250mL三角瓶，摇床，黄豆，酒精灯，载波片，

7、显微镜，香柏油，二甲苯，擦镜纸，水浴锅，电子天平，pH试纸。四、 实验步骤1. 工艺流程：大豆浸泡8，16h分装于平皿中121蒸煮20min冷却 40接种0.5mL菌悬液，37发酵10，24h4后熟0，24h。发酵工艺正交表因素浸泡发酵后熟实验结果实验18100实验282424实验3161024实验4162402.菌种制备：肉汤斜面画线接种纳豆杆菌，37培养12h，用无菌水洗下菌落，制成菌悬液，3. 菌体形态显微观察：从纳豆发酵开始，分别0h，5h，24h取样，美兰简单染色，对整个发酵过程中纳豆芽孢杆菌菌体形态变化（孢子形成）进行跟踪观察。五、实验结果1. 根据色泽、气味和口感等指标，对纳豆进

8、行感官评价，给出分值，根据正交表对实验结果进行分析，算出最佳工艺条件。分值色泽气味口感10金黄，有光泽无氨味，有纳豆特有的香味酥软，湿润8暗黄色，有光泽稍许有氨味酥软，较湿润6暗黄色有氨味较酥软，较湿润4褐色氨味重较酥软，较干2暗揭色有强烈的氛味不酥软，较干2. 根据菌体形态显微观察结果，说明纳豆芽孢杆菌变化规律。六、思考题1. 为何纳豆产品货架期较长。2. 纳豆的口味适合你吗？怎样矫味？实验三 紫外线诱变选育一、实验目的：通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法；通过本试验使学生复习以前所学的微生物学基础知识和实验技能。二、实验原理：紫外线对微生物有诱变作用

9、，主要引起是 DNA 的分子结构发生改变（同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。三、实验主要仪器设备和材料显微镜、紫外线灯（15W）、1mL无菌吸管（每组9支，塞棉花）、无菌水装试管（每组6支9mL，1支10mL）、100mL无菌三角瓶（每组1个，内装8个玻璃珠）、纳豆芽孢杆菌（每组1支）、无菌培养皿（每组9套）、10%三氯醋酸（20mL）、滴管（每组1个）、酪蛋白固体培养基1000 mL、涂布棒4个。四、实验方法1、菌悬液的制备：取培养24小时的纳豆芽孢杆菌的斜面 1支，用10mL无菌水将菌苔洗下，并装入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡10分钟，以打

10、碎菌块。2、菌悬液系列稀释：将菌悬液系列稀释为10-4、10-5、10-6、10-7。3、平板制作：将酪蛋白培养基:（酪素5g （先用0.2N的NaOH充分溶解），牛肉膏3.0g，蛋白胨 10.0g，NaCl 10.0g，pH7.07.5，H2O 1000ml,琼脂粉15.0g）溶化后，冷至55左右时倒平板，凝固后待用。4、紫外线处理：（1）将紫外线灯开关打开预热约 20 分钟。（2）平板3 套，分别加入上述10-5、10-6、10-7菌悬液 0.1mL。（3）将盛悬液平板涂布均匀，在距离为 30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟，以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂

11、平板作对照。5、培养：将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置 37培养24小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。6、观察诱变效应：将培养24小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。7、复筛观察单菌落周围的蛋白透明圈，分别挑取蛋白透明圈较大的菌落，移接到酪蛋白培养基平板纯化培养。（如透明圈不清晰，可向平板内菌落间加入少许10%三氯醋酸，过片刻再观察）五、结果六、思考题1、用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？2、经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？3、谈谈使

12、用酪蛋白培养基和三氯醋酸的原因？实验四 生物反应器的使用方法实验五 酸奶发酵剂的制备及酸奶的酿制一、实验目的 学习并掌握酸奶制作的基本原理和方法。 二、实验原理 酸奶是以牛奶等为原料，经乳酸菌发酵而成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发酵乳制品，是具有一定保健作用的食品。其基本原理是通过乳酸菌发酵牛奶中的乳糖产生乳酸，乳酸使牛奶中酪蛋白(约占全乳的29，占乳蛋白的85)变性凝固而使整个奶液呈凝乳状态。同时，通过发酵还可形成酸奶特有的香味和风味(与形成乙醛、丁二酮等有关)。按凝固状态可将酸奶分为凝固型酸奶和搅拌型酸奶，二者基本工艺过程相似，本实验主要学习凝固型酸奶的制作方法。三、实验器材 1菌种

13、： 一般选用保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。也有使用嗜酸乳杆菌(Lacidophilus)和双歧乳杆菌如两歧双歧乳杆菌(Bifidobacterium bifidum)的，目前虽然有人认为它们保健作用更好，但由于不易培养和有特殊异味，尚未全面推广使用。本实验使用前两种菌以 1：1比例混合接种。2培养基： 菌种活化及扩大用培养基：10脱脂乳液，pH自然。 发酵培养基：16全脂乳液加适当比例(如8)的白砂糖，pH自然。3器材： 试管、烧杯、三角瓶、无菌吸管、酸奶瓶、温度计、玻璃棒、酒情灯、电炉。

14、四、实验方法1工艺流程：全脂乳粉、砂糖、水 混合均匀 预热(60-70) 均质(15-18MPa) 灭菌(85-90，5-8min) 冷却(43-45) 接种 分装 封口 菌种 活化 母发酵剂 生产发酵剂保温发酵(42-43，2-3h) 酸奶瓶 清洗 开水烫洗消毒 冷藏(25，24h) 成 品2菌种活化和培养：（1)将脱脂乳液(要求乳粉或生新鲜牛乳不含抗生素)分装试管和三角瓶装量：18mm×180mm试管：15mL管；250mL三角瓶：150mL瓶。置于高压灭菌锅内115，15min灭菌。（2)将保藏菌种接入脱脂乳试管中活化2次，至凝固良好时，转接于三角瓶中(做成母发酵剂)，接种量2

15、左右。大规模生产时还需进行下一级扩大培养(即做生产发酵剂)，接种量23。 （3)生产发酵剂培养需采用较大的容器，如不锈钢桶，灭菌则采用80、15min，连续两次。灭菌后牛乳应立即冷却待用。如1h内不使用，需储放在3-5环境下。（4)培养：保加利亚乳杆菌一般在4245下培养12h，至牛乳凝固结实即可。嗜热链球菌一般在3742下培养1214h，至牛乳凝固结实即可。3发酵培养基的消毒： 将乳粉、砂糖和水按比例混合均匀(实验室小规模制作可用打浆机打浆，使充分混匀，代替均质)，在不锈钢容器(或烧杯)中加热至8590保持58min即可杀死病原菌和其它微生物。4接种： 将消毒后的牛乳迅速降温至45以下，接入

16、发酵剂的量为原料乳量的10。采用混合菌株发酵时，总接种量不变，两菌株等量接种。5分装、封口、发酵： 接种后，分装于消毒过的酸奶瓶或其它容器中，加盖或封口后送培养箱或发酵室保温发酵34h。6冷却后熟： 经检查，酸奶已达到凝固状态(pH达4243)时，取出置4条件下冷藏24h即得成品。 品尝自己制作的酸奶，判断其感官品质是否达到要求，若达不要求，分析其原因。 实验六 机械搅拌发酵罐发酵培养枯草芽孢杆菌一、实验目的   学习细菌的扩大培养，掌握实验室摇瓶操作的基本步骤；熟悉小型发酵罐的通风发酵过程；了解从生产菌种到发酵的全过程。二、实验原理从试管菌种开始，通过逐级扩大增加培养物，最终使用机

17、械搅拌罐发酵枯草芽孢杆菌。摇瓶培养是实验室常用的通风培养方法，通过装有液体培养物的三角瓶放在摇床上振荡培养，以满足微生物的生长、繁殖及产生许多代谢产物对氧的需求，它是实验室摸索工艺条件的常用方法。三、实验材料     枯草芽孢杆菌， 种子培养基，发酵培养基，恒温摇床，无菌吸管，试管，三角瓶，发酵罐 四、实验方法 1工艺流程：试管斜面菌种（12h，37）接种(1环菌苔)摇瓶种子培养液中，250mL三角瓶振荡培养（12h，37）种子培养液，接种（15）机械搅拌发酵罐发酵 2发酵罐种子液的制备摇瓶种子培养基：葡萄糖 20g，牛肉膏1g，蛋白

18、胨5g， NaCl 5g，H2 O 1000ml，pH自然 ，高压灭菌锅121灭菌20min。摇瓶种子培养基分装于250ml三角瓶，每瓶50ml。从斜面上挑取一环菌种，接入摇瓶种子培养基，37，150rpm振荡培养12小时即为种子液。 3发酵培养基制备发酵培养基：蔗糖20g，淀粉20g，酵母膏1g，蛋白胨5g， NaNO3 3g，KH2PO4 5g, CaCO3 10g，H2O 1000ml；pH7.0。淀粉糊化：淀粉：水1：4加入预热至60水中，边加边搅拌，煮沸10分钟成糊状（煮沸过程中不断搅拌）。4发酵（演示）空消：空罐灭菌。实消：将发酵培养基5L从进样口倒入15L发酵罐中，盖上

19、盖子。检查发酵罐安装完好后， 105灭菌15分钟。接种：可以采用火焰接种法，在接种口放置酒精圈，点燃后，将菌种通过火焰圈迅速倒入发酵罐内，进行计时培养。发酵：种子培养好后，将种子接到发酵罐中，接种量15，36°C一37°C 控温通风培养，搅拌转速200转分，01h，通风比l：0.50.8；35hr以后调速380转分；2428小时，通风1：1.0。每6小时测定活力一次，外观糖一次；每2小时测pH一次，记录通风量，转速、温度等。发酵过程监测时，注意观察发酵罐的结构，测定结果记录于表，测定时同时镜检。定期测定菌浓，当菌浓达到最高时结束发酵。取样：自培养操作开始起，每6h取1次样。

20、取样前后，要用蒸汽冲取样口。5注意事项：试管接摇瓶前，摇瓶培养基要设肉汤平板划线空白对照，检查摇瓶种子培养基是否灭菌彻底。种子培养液接发酵罐之前，要对种子培养液镜检，检查是否有杂菌污染。五思考题1、发酵控制应注意哪些参数？这些参数对微生物发酵有什么影响？2、在摇瓶中影响通风量的因素有哪些?3发酵时，通风搅拌是不是越强烈越好?实验七 固态发酵法红曲米红曲色素制备一、实验目的学习并掌握固态发酵法红曲米红曲色素制备的基本原理和方法。二、实验原理红曲色素是红曲霉在生长代谢过程中产生的红色天然色素。红曲霉是目前世界上唯一生产食用色素的微生物。红曲色素可以通过固体和液体发酵两种方法培养红曲霉。红曲色素与其它天然色素相比，具有热稳定性好，蛋白作用力强，色调柔和，对酸碱稳定，还可以提高加工制品对光、热和氧的稳定，而且红曲色素无毒性，无致突变作用，安全性高。红曲色素有水溶性色素和脂溶性色素两类。水溶性色素有一部分可溶于有机溶剂中，而脂溶性色素则不易溶于水中。红曲色素在乙醇和醋酸中的溶解性比较好。目前国内大致有两类:红曲米和红曲米提取物或深层发酵红曲霉提取物 。红曲霉所产生的色素已被确定出化学结构有6 种，可分为3 类， 即红色素Monasc