黄芪对高糖高脂环境下内皮细胞与系膜细胞相互作用的影响

1、黄芪对高糖高脂环境下内皮细胞与系膜细胞相互作用的影响                     作者：周素娴,赵晋晋,雷闽湘 【摘要】  目的 探讨黄芪对高糖高脂环境下内皮细胞与系膜细胞间相互作用的影响。方法 内皮细胞与系膜细胞共培养和系膜细胞单独培养,分为对照组、甘露醇组、高糖高脂组、黄芪组,培养24 h后,ELISA法检测各组细胞上清液

2、型胶原(Col )、纤维连接蛋白(Fn)的含量。结果 在高糖高脂环境下,共培养和单培养细胞上清液Col 、Fn含量升高(均P0.05),共培养上清液Col 、Fn较单培养升高(均P0.05)；黄芪组Col 、Fn含量较高糖高脂组下降(均P0.05)。结论 高糖高脂环境下,系膜细胞和内皮细胞存在异常的相互作用,这种作用能促进Col 、Fn产生( 【关键词】  高糖高脂；糖尿病肾病；内皮细胞；系膜细胞；黄芪     Abstract：Objective To&

3、#160;study the effect of astragalus membranaceus on the interaction of mesangial cells and endothelial cells in the media of high glucose and lysophosphatidylcholine. Methods The&#

4、160;model of intercellular interaction between endothelial cells and mesangial cells of diabetic nephropathy was established and divided into 4 groups：control, mannitol, high glucose an

5、d lysophosphatidylcholine, intervented with astragalus membranaceus. Endothelial cells and mesangial cells were co-cultured in DMEN with or without astragalus membranaceus in high glucose

6、60;and lysophosphatidylcholine media up to 24 hours. The level of collagen  and fibrocentin were determined by enzyme linked immunosorbent assay in the culture media. Results&

7、#160;The level of collagen  and fibrocentin of high glucose and lysophosphatidylcholine group was markedly higher than that of control group in co-culture and the ordinary

8、0;monolayer cell culture (P0.05). Intervented by high glucose and lysophosphatidylcholine, the level of collagen  and fibrocentin of co-culture was much higher than that of th

9、e ordinary monolayer cell culture (P0.05). The levels of collagen  and fibrocentin of the group intervented by astragalus membranaceus was lower than that of high glucose

10、 and lysophosphatidylcholine (P0.05). Conclusions Exposed to high glucose and lysophosphatidylcholine, endothelial cells and mesangial cells can interact with each other to promote coll

11、agen  and fibrocentin. Astragalus membranaceus can inhibit the interaction of endothelial cells and mesangial cells in the media of high glucose and lysophosphatidylcholine to 

12、;decrease the level of collagen  and fibrocentin and has protective effect on the kidney.     Key words：high glucose and lysophosphatidylcholine；diabetic nephropathy；endothelial ce

13、ll；mesangial cell；astragalus membranaceus     糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的主要微血管并发症之一。研究发现,肾小球内皮细胞与系膜细胞间的相互作用参与DN的发生发展1。中药黄芪具有肾保护作用2。我们构建在高糖高脂条件下内皮细胞与系膜细胞共培养模型3,检测细胞上清液中型胶原(Collagen ,Col )和纤维连接蛋白(fibrocentin,Fn)的变化,探讨黄芪对高糖高脂条件下内皮细胞和系膜细胞间相互作用的影响

14、。 1  材料与方法 1.1  细胞株、药物及试剂 人脐静脉内皮细胞株(HUVEC-12,编号CRL-2480),北京大学医学院肿瘤研究所提供,属于正常的人脐带静脉内皮细胞。人肾小球系膜细胞(Human mesangial cells,HMCs),东南大学附属中大医院内分泌科孙子林教授惠赠(医药学/临床医学论文 1.2  含药血清的制备     以临床成人用药量等效剂量的2倍,将黄芪水煎并浓缩至含原药材1.5 g/mL,每日灌服大鼠药液4 mL,每日2&#

15、160;次,连续5 d,在灌服最后1剂后2 h,经眼球取血,灭活补体后0.22 m无菌滤器过滤,分装,-20 冰箱保存。 1.3  细胞培养与分组 HMCs单培养模型：HMCs 80%融合时,消化后制成细胞悬液,以2×105/mL浓度传至6孔板中单独培养；HUVECs与HMCs共培养模型：将已成80%融合状态的HMCs和HUVECs消化后制成细胞悬液,HUVECs以1×105/mL浓度接种于普通6孔培养板, HMCs以2×105/mL浓度接种到Millicell插入式培养皿中,上下层细

16、胞没有直接物理接触,但共享相同的培养液。待细胞呈融合状态后,进入静止期后分组。两个模型各分为：对照组(5.5 mmol/L D-葡萄糖)、甘露醇组(24.5 mmol/L甘露醇)、高糖高脂组(30 mmol/L D-葡萄糖20 mg/L LPC)、黄芪组(30 mmol/L D-葡萄糖20 mg/L LPC120 L 黄芪含药血清,加入120 L黄芪含药血清预处理1 h后,加入D-葡萄糖、LPC,工作浓度分别为30 mmol/L、20&

17、#160;mg/L)。各组细胞培养24 h,实验均重复3次。 免费论文下载中心  1.4  指标检测     分别按ELISA试剂盒说明书测定各组细胞上清液Col 、Fn含量。 1.5  统计学方法     采用SPSS13.0统计软件进行数据处理,以x±s表示,独立样本2组间差异比较用t检验；组间差异采用方差分析,组间两两比较采用SNK法,P0.05表示差异有统计学意义。 2  结果 (见表1)表1

18、60; 各组Fn、Col 的变化比较(略)注：与单培养对照组比较,*P0.05；与共培养对照组比较,#P0.05；      与高糖高脂组比较,P0.05 3  讨论     DN的发生与病程中的代谢紊乱,如糖、脂代谢紊乱密切相关。Col 和Fn是构成基底膜的主要胶原成分,主要沉积在肾小球、肾小管基底膜和鲍曼囊,早期增生,转换率较快,其合成与降解代谢不平衡,造成肾小球硬化的发生、进展4。本研究发现,共培养和单独培养高糖高脂均可促进系膜细胞Col&

19、#160;和Fn产生增加,而系膜细胞Col 和Fn过度表达直接导致细胞外基质(ECM)的积聚,支持高糖高脂是DN发生、发展的危险因素。     肾小球内皮细胞是肾小球毛细血管壁的首道屏障,因而成为血液中各种病理生理因素作用的靶细胞。系膜细胞因为内皮细胞的阻挡不能直接接触血液,但它们处于同一微环境中,通过基底膜相连,一方的改变会对另一方产生影响。王氏等1将系膜细胞与内皮细胞置于特殊装置中共同培养,发现在高糖条件下,系膜细胞和内皮细胞间存在异常相互作用,这种作用可促进肾细胞活性氧的产生增加。     实验发现

20、,加入内皮细胞共培养后,细胞上清液Col 和Fn的含量均较系膜细胞单独培养增高。提示在高糖和高脂作用下,内皮细胞可受损和产生一系列的变化,而内皮细胞产生的变化会对系膜细胞造成影响,促进其分泌Col 和Fn增多,内皮细胞和系膜细胞之间可能存在异常的相互作用,导致损伤反应在肾小球局部不断放大,加重ECM的积聚。     黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根,其性温,味甘,有补气固表、益气补中、利尿托毒和敛疮生肌的功效。研究发现,黄芪注射液能显著降低DN患者24 h尿白蛋白排泄率,降低血Col 和转化生长因子-1(T

21、GF-1)水平5。在动物实验中,黄芪能抑制DN大鼠肾组织中的促纤维化因子TGF-1 mRNA的表达6。本研究也发现,黄芪可抑制高糖高脂条件下共培养组的Col 、Fn分泌增加,提示黄芪对病理条件下的内皮细胞和系膜细胞具有保护作用。     综上所述,在高糖高脂环境下,内皮细胞与系膜细胞之间存在异常的相互作用,导致损伤反应在肾小球局部不断放大,ECM沉积,促进DN的发生、发展。内皮功能障碍可能是DN发生发展的始动因素。 【参考文献】  1 王 凯,邓 红,赵 龙,等.高糖环境下肾

22、小球系膜细胞和内皮细胞相互作用对活性氧产生的影响以及茶多酚的干预作用J.东南大学学报(医学版),2004,23(3)：151154.2 郑 宏,翟文生,任现志,等.黄芪、水蛭含药血清对大鼠肾小球系膜细胞产生TGF-1的影响J.天津医药,2007,35(7)：509511.3 Nakano N, Morishita R, Moriguchi A, et al. Negetive regulation of local hepatocyte growth factor expres