鲁米诺_过氧化氢化学发光体系测定酪氨酸

1、鲁米诺 过氧化氢化学发光体系测定酪氨酸樊雪梅 *, 王书民 , 刘 萍(商洛学院化学与化学工程系 , 商洛 726000摘 要 :碱性条件下 , H 2O 2氧化鲁米诺产生化学发光 , 酪氨酸对该体系的化 学发光信号具有显著的抑制作用 。 据此建立了一种直接测定酪氨酸的流动注射 化学发光分析新方法 。 该方法线性范围为 4 0 10-72 0 10-5m o l/L, 检出 限为 1 0 10-7m o l/L。 对 8 0 10-6m o l/L的酪氨酸平行测定 6次 , 其相对标 准偏差为 2 9%。 该方法可应用于尿液中酪氨酸的测定 。关键词 :流动注射 ; 化学发光 ; 鲁米诺 ; 过

2、氧化氢 ; 酪氨酸中图分类号 :O 657 2 文献标识码 :A 文章编号 :1000 0720(2010 10 053 03酪氨酸是人体内合成蛋白质所需的重要氨基 酸之一 , 对于促进人体的生长发育有着重要的作 用。如果人体内酪氨酸含量失衡 , 则会出现代谢 异常、智力 低下、抑 郁等疾 病 1。因 此 , 准 确、 灵敏地测定人体组织及体液中酪氨酸的含量在营 养学、临床医学上都具有重要意义。目前 , 测定 酪氨 酸 的 方 法 有 荧 光 分 析 法 2, 3、 分 光 光 度 法 4, 5、高 效液 相 色谱 法 6, 7、电 化学 法 8, 9等 , 而采用流动注射化学发光分析法测定酪

3、氨酸的报 道较少 10, 11。本文发 现 , 碱性条件 下 , 酪氨 酸对 H 2O 2氧 化鲁米诺产生的化学发光信号具有显著的抑制作 用 , 结合流动注射 , 建立了测定酪氨酸的流动注 射化学发光新方法 , 并用于尿液中酪氨酸的含量 分析。1 实验部分1 1 仪器和试剂I FF M E 型流动注射化学发光分析仪 (西安瑞 迈电子科技公司 ; I FFS A 型多功能化学发光检 测器 (西安瑞迈电子科技公司 ; F 4600荧光分光 光度计 (日立公司 , P H S 3C 型 p H 计 (上海雷磁 仪器厂 1 0 10-2m o l/L鲁米诺 (陕西师范大学分析 科学研究所 储备液 :称

4、取鲁米诺 177 10m g , 用 1 0m o l/L的 Na OH 溶液 10mL 溶解 , 加水定容至 100m L , 室温下放置 7d 后使用 ; 酪氨酸标准溶 液 :配制浓度为 1 0 10-3m ol/L标准溶液于冰箱 中保存 ; H 2O 2溶液 :2 0 10-3m o l/L。所用试剂 均为分析纯 , 水为二次蒸馏水。1 2 实验方法实验流路如图 l 所示。管路为内径 0 8mm 的 聚四 氟乙 烯 管 (PTFE , 光 电 倍 增 管 负 高压 为图 1 流动注射化学发光分析流路图Fig 1 Sch e m atic diagra m of flo w i n jec

5、 ti on che m ilu m i nescen ce analysisa 酪氨 酸 ; b 鲁 米 诺 +N a2CO3; c H2O2; P1、 P 2主、副蠕动 泵 ; M 混 合 器 ; V 八 通 阀 ; F 流 通 池 ; PM T 检测器 ; HV 负高压 ; W 废液 ; COM 计算机 700V, 增 益 为 l 。 分 别 将 载 流 (水 、 鲁 米 诺*收稿日期 :2010 01 14; 修订日期 :2010 03 01基金项目 :商洛学院 (07SKY029 项目资助作者简介 :樊雪梅 (1980- , 女 , 讲师 ; E m ai:l fanxuem ei

6、527163 comN a 2C O 3溶液以及 H 2O 2溶液通过相应 管道输入分 析系统 , 记录发光信号 I 0, 以样品溶液代替二次 蒸馏水 , 记录反应的发光信号 I , 以相对峰高 ! I =I 0-I 定量。2 结果与讨论2 1 化学发光光谱曲线碱性鲁米诺 H 2O 2体系有 很强的化 学发光信 号 , 酪氨酸对该发光体系有较强的抑制作用 , 其 动力学曲线如图 2 所示。图 2 酪氨酸加入前 (a 后 (b 体系的流动注射化学发光曲线Fig 2 T he ch arac ter istics of flo w i n jecti on chem ilum i n escen

7、ce reaction i n the ab sen ce oftyrosi n e (a and the p resen ce of pal m ati n e (ba-2 5 10-4mo l/L鲁米诺 +2 0 10-3m o l/LH 2O 2 b-a+1 5 10-5mo l/L酪氨酸2 2 实验条件的优化2 2 1 仪器参数的选择 在流动注射分析中 , 蠕 动泵的泵速是影响测定灵 敏度的一个重 要因素。 结果表明 , 当主、副泵的泵速分别为 40r/mi n 和 20r /mi n 时 , 发光信号最强且稳定。2 2 2 反应介质及酸度 分别考察了相同浓度的 N a 2C O 3、

8、 Na 2CO 3 Na HCO 3、 Na HC O 3 Na OH 、 N a OH 4种介质中体系的化学发光强度。结果表明 , 在 p H 11 8的 N a 2CO 3介质中 , 信噪比最大 且发光信 号稳定 , 故选择 pH 11 8的 N a 2CO 3介质用于实验。 2 2 3 鲁 米 诺 浓 度 的 选 择 在 1 0 10-51 0 10-3m o l/L范围内考察了不同浓度的鲁米诺 对发光强度的影响 , 实验表明 :鲁米诺的浓度为2 5 10-4m o l/L时 , 体系的 ! I 值最大。2 2 4 H 2O 2浓度 的 选择 H 2O 2浓 度 为 2 010-3m o

9、 l/L时 , 酪氨酸对鲁米诺 H 2O 2体系的抑制 作 用 最 佳 , 故 实 验 选 择 H 2O 2浓 度 为 2 010-3m o l/L。 2 3 线性范围 、 精密度和检出限在上述最佳条件下 , 酪氨酸浓度与发光强度 的降低值 ! I 在 4 0 10-72 0 10-5m ol/L呈良好的线性关系 , 线性回归方程 为 :l g I =6 74+0 94lg c Tyr (m o l/L 。相关系数 r=9965, 检出限为 1 0 10-7m ol/L, 对 8 0 10-6m o l/L酪氨酸标 准 溶 液 平 行 测 定 6次 , 相 对 标 准 偏 差为 2 9%。2

10、4 共存物质的影响在选定 的实验 条件下 , 对 8 0 10-6mo l/L酪氨酸溶液进行了干扰试验。结果表明 , 当相对 误差为 5%时 , 1000倍 的 Zn 2+、 M g 2+、 Cu 2+、 K +、 N a +、 C l -、 C a 2+; 500倍的 丙 氨 酸、 丝氨 酸、谷氨 酸、 赖氨 酸 ; 100倍 精 氨酸 , 胱 氨酸 ;30倍的苯丙氨酸 ; 20倍的色氨酸不干扰测定。2 5 样品分析取 1 00mL 新鲜尿样于 100mL 容量瓶中 , 用 蒸馏水稀释至刻度即为分析样品 , 按实验方法进行样品分析和回收率测定 , 结果列于表 1。表 1 样品测定和回收率试验

11、结果Tab 1 Deter m i nation resu lts of tyrosine i n human urine sa m p l e s (n =6样品编号测定值c /(10-6m o l/L相对标准偏差/%加入量c /(10-6m ol/L测得总量c /(10-5mo l/L回收率 /%15 02 95 01 1110 25 52 85 01 095 2 36 13 45 01 21083 反应机理的探讨鲁米诺在碱性溶液中 失去一个 H +, 成为带 负电的基团 , 继而被某些氧化剂氧化生成 3 氨 基 邻苯二甲酸根离子。氧化过程中产生的化学能被 3 氨基邻苯二甲酸根离子吸收 ,

12、 使其处于激发态 , 其价电子由单线第一电子激发态的最低振动能级 跃迁到基态各个不同振动能级时 , 便会产生最大 波长为 425nm 的光。实验中 , 我们以荧光仪扫描 了鲁米诺 H 2O 2和鲁米诺 H 2O 2 酪 氨酸化学发光体 系的发光光谱。发现加入酪氨酸后 , 发射的最大 波长仍为 425nm, 说明该体系的发光体仍为激发 态的 3 氨基邻苯二甲酸根离子。一般认为 , 从鲁 米诺到 3 氨 基邻苯二甲酸 根离子的形成 过程中 , 形成了一系列的中间产物如氧化性自由基等。我 们认为酪氨酸可能与中间产物作用形成了不发光 的产物 , 使激发态的 3 氨 基邻苯二甲酸根离子的 数目减少 ,

13、从而使鲁米诺化学发光反应受到抑制。参考文献1 沈仁权 , 顾其敏 , 李泳棠等 基础生 物化学 上海 :上海科学技术出版社 , 1980 802 王 全林 , 刘 志 洪 , 蔡 汝秀 等 分 析试 验 室 , 2004, 13(2:503 肖劲 , 任凤莲 , 宋鸽等 光谱 学和光 谱分析 , 2007, 19(11:1864 倪永年 , 蔡英俊 食品科学 , 2008, 10(3:399 5 薛 建 国 , 傅 敏 恭 , 杨 伟 平 分 析 试 验 室 , 2001, 8(2:246 杨开杰 科技创新导报 , 2008, 28(5 :117 L ete lli e r S , G a m

14、 ier J P J Chrom atogr B , B io m ed i Sci App , 1997, 696(1:98 张 卉 , 汪振辉 分析试验室 , 2005, 24(3:27 9 何 琼 分析科学学报 , 2003, 19(4 :34610 张小燕 , 范晓东 , 高新 分析化学 , 2004, 30(12: 13111 Spi nks C A, W ya tt G M, Everest S , e t a1 J Sci F ood A gr i c , 2002, 82(4:428F low inj ection che m ilu m inescenc m et hod f

15、or deter m i n ation of tyrosi n e based on l u m i n ol H 2O 2reacti o n FAN X ue m ei *, WANG Shu m in and LIU P ing (Che m istry and Che m icalEng ineeri n g depart m ent o f Shuo l u o Co l lege , Shang l u o 726000, Fenx i Sh i y ansh, i 2010, 29(10:5355Abst ract :A novel flo w i n jecti o n ch

16、e m ilu m i n escence m ethod w as developed for the deter m i n ation of tyrosi n e , based on the strong i n hi b ited effect of ty r osi n e on the che m il u m inescence reaction of hydrogen perox ide and lum i no1i n basic m edium The experi m ental resu lts i n dica ted tha, t under opti m um conditi o ns , the che m il u m ines cence i n tensity w as 1inearly related to the concentrati o n of tyrosi n e i n the ra nge o f 4 0 10-72 0 10-5m ol/L w it h a detecti o n li m it of 1 0 10-7m o l/L.The RSD for m easu